Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten
Summary
Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.
Abstract
Die ECLIA ist eine vielseitige Methode, die in der Lage ist, endogene und rekombinante Proteinmengen in einem 96-Well-Format zu quantifizieren. Um die ECLIA-Effizienz zu demonstrieren, wurde dieser Test verwendet, um intrinsische Konzentrationen von MeCP2 im Gehirngewebe der Maus und die Aufnahme von TAT-MeCP2 in humanen dermalen Fibroblasten zu analysieren. Der MeCP2-ECLIA erzeugt hochpräzise und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler. Zusammenfassend haben wir eine quantitative Methode zur Bewertung von MeCP2-Proteinvarianten entwickelt, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen eingesetzt werden können.
Introduction
Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) basiert auf einem Verfahren, bei dem Etiketten verwendet werden, die bei elektrochemisch stimulierter Lumineszenz emittiert werden. Es ist eine allgemein anwendbare Technik für den quantitativen Nachweis biologischer Analyten in der Grundlagenindustrie und der akademischen Forschung, der Lebensmittelindustrie sowie in der klinischen Diagnostik1. Üblicherweise wird eine Einwegplatte mit Carbon-Tintenelektroden verwendet. Diese Elektroden fungieren als Festphasenträger für den Immunoassay. Ein sekundärer Antikörper wird mit einem elektrochemilumineszierenden Etikett konjugiert und wenn Strom auf das System aufgebracht wird, wird die Lichtemission des chemischen Etiketts ausgelöst. Ein ultra-low noise charge coupled device (CCD) zeichnet die Lichtintensität auf, die direkt proportional zum Antigen ist, das an den Aufnahmeantikörper gebunden ist, was zur Quantifizierung des Zielanalyten der Probe2führt. Im Vergleich zum enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) gilt ECLIA als vorteilhaft, da es eine höhere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine bessere Automatisierung und Konsistenzbietet 3.
Hier analysierten wir die Methyl-CpG-Bindungsprotein-2 (MeCP2)-Spiegel in Proben menschlichen und murinen Ursprungs sowie verschiedene Varianten des rekombinanten Proteins mit dem neu entwickelten ECLIA-System. MecP2 ist ein X-verknüpftes Nukleinsäure-bindendes Protein, das bekanntermaßen mit methylierten DNA-Sequenzen interagiert. Dieses Protein ist in die Regulation der Genexpression4,5verwickelt. Funktionsverlustmutationen im Gen, die dieses Protein kodiert, sind die Hauptschuldigen, die das Rett-Syndrom (RTT), eine schwere neuroentwicklungsbedingten Störungverursachen 6. Eine weitere MeCP2-bedingte Erkrankung, das MECP2-Duplikationssyndrom, führt auch zu neurologischen Symptomen, die sich mit denen von RTT7überschneiden können. MECP2 Insbesondere sind Frauen meist von RTT betroffen, während Männer meist vom MECP2-Duplikationssyndrom 6,7betroffen sind.
Diese Störungen sind mit unzureichenden oder überschüssigen MeCP2-Spiegeln bzw. im Zentralnervensystem (ZNS) verbunden. Daher müssten Behandlungsoptionen für RTT, die eine Erhöhung des MeCP2-Spiegels im CNS beinhalten, die nachteiligen Auswirkungen im Zusammenhang mit einem Überschuss an MeCP27vermieden werden. Aufgrund dieser Tatsache ist eine hochsensible und genaue Quantifizierung des MeCP2-Proteinspiegels, wie sie vom ECLIA-System bereitgestellt wird, entscheidend für die Weiterentwicklung der RTT sowie der Forschung zum MECP2-Duplizierungssyndrom. MECP2 Die präzisen Messungen von endogenen und exogenen MeCP2-Spiegeln aus menschlichen Zelllinien und Mausgewebeproben sowie eines rekombinanten Proteins bestehend aus humanem MeCP2-Isoform B (auch bekannt als Isoform e1) und einer minimalen N-terminalen HIV-TAT-Transduktionsdomäne (TAT-MeCP2), die das Potenzial hat, die Blut-Hirn-Schranke8,,9 zu überqueren, werden in dieser Arbeit vorgestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zur Messung der endogenen MeCP2-, rekombinanten MeCP2- und TAT-MeCP2-Spiegel wurde eine 96-Well-Platte ECLIA entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass der Verlust der MeCP2-Proteinfunktion zum RTT-Syndrom6führt, für das die Behandlung derzeit auf Symptommanagement und Physiotherapie beschränkt ist. Eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist die sogenannte Proteinersatztherapie, bei der MeCP2-Spiegel bis zu ihrer benötigten Konzentration12,,<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Brigitte Sturm für ihre Unterstützung beim ECLIA-Instrument.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
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