Summary
Il metodo descritto di seguito mira a fornire un protocollo completo per la preparazione della neurochirurgia dei primati non umani (NHP) utilizzando una nuova combinazione di metodi di stampa tridimensionali (3D) ed estrazione di dati MRI.
Abstract
In questo documento, delineamo un metodo per la preparazione chirurgica che consente la pianificazione pratica di una varietà di neurochirurgia negli NSP esclusivamente utilizzando dati estratti dalla risonanza magnetica (MRI). Questo protocollo consente la generazione di modelli fisici anatomicamente accurati stampati in 3D del cervello e del cranio, nonché un modello di gel di agarosio del cervello che modella alcune delle proprietà meccaniche del cervello. Questi modelli possono essere estratti dalla risonanza prima utilizzando il software di estrazione cerebrale per il modello del cervello e il codice personalizzato per il modello del cranio. Il protocollo di preparazione sfrutta la tecnologia di stampa 3D all'avanguardia per realizzare cervelli, teschi e stampi interfaccianti per modelli cerebrali in gel. I modelli del cranio e del cervello possono essere utilizzati per visualizzare il tessuto cerebrale all'interno del cranio con l'aggiunta di una craniotomia nel codice personalizzato, consentendo una migliore preparazione per gli interventi chirurgici che coinvolgono direttamente il cervello. Le applicazioni di questi metodi sono progettate per gli interventi chirurgici coinvolti nella stimolazione neurologica e nella registrazione, nonché nell'iniezione, ma la versatilità del sistema consente una futura espansione del protocollo, delle tecniche di estrazione e dei modelli a una più ampia gamma di interventi chirurgici.
Introduction
La ricerca sui primati è stata un passo fondamentale nella progressione della ricerca medica dai modelli animali alle sperimentazionisull'uomo 1,2. Ciò è particolarmente vero nello studio delle neuroscienze e dell'ingegneria neurale in quanto esiste una grande discrepanza fisiologica e anatomica tra il cervello dei roditori e quelli dei primati non umani (NHP)1,2,3. Con tecnologie genetiche emergenti come la chemiogenetica, l'optogenetica e l'imaging del calcio che richiedono la modificazione genetica dei neuroni, la ricerca sull'ingegneria neurale che studia la funzione neurale negli NHP ha acquisito particolare attenzione come modello preclinico per la comprensionedella funzione cerebrale 2,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Nella maggior parte degli esperimenti di neuroscienze NHP, sono necessarie misure neurochirurgiche per l'impianto di vari dispositivi come pali della testa, camere di stimolazione e registrazione, array di elettrodi e finestre ottiche4,5,6,7,10,11,13,14,15,17,18.
Gli attuali laboratori NHP usano una varietà di metodi che spesso includono pratiche inefficaci tra cui sedare l'animale per adattarsi alle gambe di un palo della testa e approssimare la curvatura del cranio intorno al sito di craniotomia. Altri laboratori si adattano al palo della testa al cranio in chirurgia o impiegano metodi più avanzati per ottenere le misure necessarie per l'impianto come l'analisi di un atlante cerebrale NHP e scansioni di risonanza magnetica (MR) per cercare di stimare le curvature delcranio 2,10,11,16. Le neurochirurgia negli NSP coinvolgono anche iniezioni di liquidi e i laboratori spesso non hanno modo di visualizzare la posizione di iniezione proiettataall'interno del cervello 2,4,5,13,14 basandosi esclusivamente su misurazioni stereotassiche e confronto con le scansioni MR. Questi metodi hanno un grado di inevitabile incertezza dall'essere in grado di testare la compatibilità fisica di tutti i componenti complessi dell'impianto.
Pertanto, è necessario un metodo non invasivo accurato per la pianificazione neurochirurgica negli NSP. Qui, presentiamo un protocollo e una metodologia per la preparazione di interventi chirurgici di impianto e iniezione in questi animali. L'intero processo deriva dalle scansioni MRI, in cui il cervello e il cranio vengono estratti dai dati per creare modelli tridimensionali (3D) che possono quindi essere stampati in 3D. I modelli del cranio e del cervello possono essere combinati per prepararsi agli interventi di craniotomia e ai posti della testa con un maggiore livello di precisione. Il modello cerebrale può anche essere utilizzato per creare uno stampo per la fusione di un modello di gel anatomicamente accurato del cervello. Il cervello gel da solo e in combinazione con un cranio estratto può essere utilizzato per prepararsi per una varietà di interventi chirurgici di iniezione. Di seguito descriveremo ciascuno dei passaggi necessari per la cassetta degli attrezzi basata sulla risonanza prima per la preparazione neurochirurgica.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Washington. Sono stati usati due macachi rhesus maschi (scimmia H: 14,9 kg e 7 anni, scimmia L: 14,8 kg e 6 anni).
1. Acquisizione di immagini
- Trasportare la scimmia su uno scanner 3T MRI e posizionare l'animale in un telaio stereotassico compatibile con MR(Table of Materials).
- Registrare il T1 standard (angolo di capovolgimento = 8°, tempo di ripetizione/tempo di eco = 7,5/3,69 s, dimensione matrice = 432 x 432 x 80, durata di acquisizione = 103,7 s, Multicoil ( Tabella deimateriali), numero di medie = 1, spessore della fetta = 1 mm) immagini MR anatomiche.
NOTA: Per un corretto isolamento del cranio, utilizzare i parametri di acquisizione della risonanza prima applicazione qui applicati per massimizzare la separazione tra cranio e cervello.
2. Estrazione cerebrale
- Nel software di imaging MR per l'estrazione cerebrale selezionare Open | Apri immagine. Caricare la scansione MPRAGE (Rapid Gradient Echo) preparata con magnetizzazione rapida T1 acquisita nel passaggio 1.2 in un software di imaging MR(Table of Materials).
- Per estrarre il cervello, nel menu a discesa Plugins selezionare Extract Brain (BET). Estrarre a una soglia di intensità intorno a 0,5− 0,7 e impostare il valore del gradiente di soglia su 0. Utilizzare ripetutamente la funzione di estrazione a soglie di intensità successivamente inferiori fino a quando la scansione non contiene solo l'anatomia corticale (Figura 1B).
NOTA: Questo è un processo iterativo perché il software non è progettato per il cervello NHP e l'estrazione non è precisa - Nel menu area di interesse (ROI) selezionare Soglia da ROI e selezionare l'opzione Per Shrink Wrap e 3D per creare una bitmap del cervello. Questo convertirà il volume in bit binari da una sfumatura, semplificando i futuri processi di generazione del modello. Scegli una soglia (di solito intorno a 600) per isolare il cervello dal tessuto circostante. Questa soglia può essere trovata passando il mouse sulla materia grigia. Selezionare OK per formare la bitmap.
- Per creare una superficie, selezionate Crea superficie (Build Surface) nel menu immagine e immettete la soglia utilizzata per estrarre il cervello nel passaggio 2.3. Quindi selezionare OK. La superficie risultante può essere utilizzata come riferimento per regolare il valore soglia per produrre la rappresentazione di altissima qualità dell'anatomia mirata (Figura 1C).
- Nella scheda File selezionare Salva o Salva con nomee salvare il ROI cerebrale estratto come file .nii o .nii.gz da utilizzare per la creazione del modello del cervello.
3. Modellazione cerebrale
- Selezionare Carica dati | Scegliere File per aggiungere e caricare il cervello estratto salvato nel tipo di file .nii o .nii.gz nel software di elaborazione delle immagini mediche (Table of Materials).
- Posizionare il puntatore del mouse sul menu a discesa benvenuto nel filtro dei dati nella barra degli strumenti dei moduli e passare a tutti i moduli. In tale menu selezionare la funzionalità Editor. Fare clic su OK nell'avviso popup.
- Dal menu del modulo Editor, selezionate Effetto soglia e regolate i dispositivi di scorrimento dell'intervallo di soglia in modo che la parte della bitmap contenente il cervello sia evidenziata in tutte e tre le sezioni. Quando si carica una bitmap, la regolazione di entrambi i dispositivi di scorrimento su un valore pari a 1 seleziona l'intero cervello. Selezionare Applica.
- Aprire il modulo creatore di modelli e nel menu a discesa volumi di input selezionare il file bitmap generato nel passaggio 3.3. In Modelli selezionare Crea nuova gerarchia di modelli. Dopo aver assegnato il nome del modello alla gerarchia, selezionate Applica per creare il volume.
- Salvare il file nel formato stl.
- Per modificare ulteriormente il modello cerebrale, caricare il file stl come corpo grafico in un software di progettazione computerizzata (Table of Materials)
NOTA: Questo può richiedere del tempo, poiché le superfici cerebrali a rete importate sono spesso piuttosto complesse. - Una volta importato il file, nell'albero delle funzionalità sul lato sinistro dello schermo fare clic sui figli del corpo grafico e sopprimere le funzionalità grafiche non necessarie fino a quando nel file rimangono solo le funzionalità contenenti il cervello. Salvare il file rimanente come prt per ulteriori manipolazioni e come stl per la stampa 3D. Salvare il file rimanente come prt per ulteriori manipolazioni e come stl per la stampa 3D.
4. Stampaggio cerebrale
- Caricare il modello cerebrale estratto dalla sezione 3 al software di progettazione aiutato dal computer aprendo il file prt. Nella sezione Feature del menu inserisci selezionare Converti in corpo mesh. Selezionare il corpo grafico del cervello e convertirlo.
- Creazione di uno stampo destro e sinistro del cervello pieno
- Fate clic sul pulsante Sketch e selezionate il piano superiore come piano di sketch. Disegna un rettangolo contenente l'intero emisfero destro o sinistro del cervello. Selezionate la feature boss/base di estrusione mentre lo sketch ed estrudete un rettangolo cubico per contenere la parte superiore del cervello.
NOTA: Il cubo potrebbe essere estruso in due direzioni per contenere l'intero emisfero. Questo perché il punto zero, dove si trova il piano di estrusione, può cadere all'interno del modello cerebrale. L'estrusione in entrambe le direzioni assicura che lo stampo comprenda l'intero volume di interesse. - Nella sezione Feature del menu 'inserisci', selezionate Converti in corpo mesh. Selezionate il cubo estruso nella cartella Corpi solidi (Solid bodies) e convertitelo. Per creare lo spazio negativo, sottrarre il modello del cervello dal cubo appena estruso utilizzando la funzione Combina e selezionando l'opzione sottrai.
- Ripetere i passaggi 4.2.1 e 4.2.2 per l'altro emisfero del cervello (a sinistra o a destra) e salvare i file risultanti come .stl per la stampa 3D e .prt per ulteriori manipolazioni.
- Fate clic sul pulsante Sketch e selezionate il piano superiore come piano di sketch. Disegna un rettangolo contenente l'intero emisfero destro o sinistro del cervello. Selezionate la feature boss/base di estrusione mentre lo sketch ed estrudete un rettangolo cubico per contenere la parte superiore del cervello.
- Creare uno stampo destro e sinistro della metà superiore del cervello.
- Create uno schizzo nel piano superiore e disegnate un rettangolo contenente l'intero emisfero destro o sinistro del cervello. Selezionate la feature boss/base di estrusione mentre lo sketch e l'estrusione vengono selezionati con la feature Offset from Plane selezionata. Sfalsare l'estrusione fino a una distanza in cui non ci sono contorni strapiombanti nell'anatomia cerebrale, catturando solo l'anatomia superiore. Nella sezione Feature del menu 'inserisci', selezionate Converti in corpo mesh. Selezionate il cubo estruso nella cartella Corpi solidi (Solid bodies) e convertitelo.
- Per creare lo spazio negativo, sottrarre il modello del cervello dal cubo appena estruso utilizzando la funzione Combina e selezionando l'opzione sottrai.
- Create un piano di sketch sul lato dorsale dello stampo e selezionate Converti entità (Convert Entities), quindi selezionate lo sketch dal passaggio 4.3.1.
- Selezionate la feature boss/base di estrusione mentre si trova nello sketch e, con l'opzione di estrusione cieca selezionata, estrudete il corpo solido di circa 5 mm per racchiudere completamente l'anatomia del cervello sottratta nello stampo.
- Ripetere i passaggi 4.3.1−4.3.4 per l'altro emisfero del cervello (a sinistra o a destra) e salvare i file risultanti come .stl per la stampa 3D e .prt per ulteriori manipolazioni.
- Modificando le dimensioni e la posizione del cubo e seguendo lo stesso protocollo (passaggi 4.1 e 4.2), creare stampi che contengono diverse parti del cervello.
- Per la stampa 3D, utilizzare una densità di riempimento di ~70% e aumentare lo spessore del guscio esterno della stampa al fine di ridurre al minimo le perdite del materiale di stampaggio. Se ci sono lacune o difetti nella stampa, riempirli usando lo smalto per unghie o un altro agente legante.
5. Modellazione del cranio
- Importare la risonanza rapida mprage dal passaggio 1.2 nel software di manipolazione delle matrici come file DICOM. Il file DICOM può essere in frame 2D separati. In questo caso, combina tutti i fotogrammi in una matrice 3D. Assicurarsi che ogni fotogramma 2D della matrice visualizzi una fetta coronale.
- Creare una maschera binaria sogliendo la matrice 3D utilizzando un operatore maggiore di per i singoli valori di pixel. Regolare la soglia in modo che l'anatomia del cranio venga acquisita dalla maschera (vedere file di codifica supplementare CalibrateMask).
NOTA: la maschera conterrà quattro livelli distinti. Dall'esterno in, saranno indicati come "fuori", "muscolatura", "teschio" e "cervello". In questa fase, "fuori" e "cranio" sono 0 nella maschera, e "muscolatura" e "cervello" sono 1. - Per rimuovere il livello "muscolatura", elaborare ogni fotogramma dalla maschera 3D separatamente afferrando iterativamente una fetta 2D dalla maschera (ad esempio, 3D_Mask(:,:,1)).
- Per ogni fotogramma, selezionate 0 pixel dagli angoli della cornice nel livello "esterno" come "seme". Quindi cerca gli 0 vicini fino a quando non incontri un pixel 1. Continua a cercare fino a quando non è possibile trovare più 0. Converti tutti gli 0 collegati in 1. Questa viene eseguita utilizzando la funzione Matlab "imfill", con gli input e gli output [MASK2] = imfill(MASK1,LOCATIONS,CONNECTIVITY), dove MASK1 è la maschera originale e MASK2 è la maschera compilata (vedere file di codifica supplementare FillExterior).
- Alcune informazioni sul cranio si perderanno durante la rimozione. Per ridurre la perdita di informazioni, eseguire il passaggio 5.3 in tutte e tre le dimensioni dei dati e mantenerli separati.
NOTA: Ora sia "fuori" che "muscolatura" sono 1 e saranno considerati come "esterni". La maschera ora contiene tre strati distinti, "esterno", "teschio" e "cervello". "Fuori" e "cervello" sono 1, e "cranio" è 0. - Invertire i valori della maschera utilizzando l'operatore ~ (ad esempio, MASK2 = ~MASK1). Ora "teschio" è 1 e "esterno" e "cervello" sono 0.
- Gli 1 che si toccano in ogni maschera possono essere considerati "oggetti". Creare un indice di tutti gli oggetti in ogni maschera utilizzando la funzione Matlab "bwconncomp", con gli input e gli output [CC] = bwconncomp(MASK), dove MASK è la matrice maschera 3D, e CC è un oggetto strutturale contenente i valori di indice di per ogni oggetto, il numero di oggetti e la dimensione della matrice. Per ogni maschera, rimuovere tutti gli oggetti ad eccezione di quello più grande contenente il maggior numero di voxel impostando i valori degli oggetti più piccoli su 0 (vedere File di codifica supplementare RemoveNoise).
- Aggiungere le maschere create da ogni passaggio insieme (vedere File di codifica supplementare MergeMasks).
- Scalare il cervello a una risoluzione coerente.
- Dall'intestazione DICOM confrontare la dimensione del passaggio tra ogni fotogramma della risonanza totale del mouse e le dimensioni di ogni pixel.
- Se questi valori sono diversi, definire un fattore di scala per compensare la differenza di risoluzione tra la dimensione del passo e la dimensione dei pixel per ogni voxel. Ad esempio, se ogni fotogramma è distante 1 mm e la dimensione del pixel è 0,33 mm x 0,33 mm, il fattore di scala sarà 3.
- Aggiungere ulteriori voxel vuoti alla maschera 3D fino a quando la dimensione di risoluzione più bassa della maschera non è maggiore di un fattore definito dal fattore di scala (vedere file di codifica supplementare "ScaleMask").
- Interpolare linearmente i valori nella maschera fino a quando la maschera non riempie il nuovo spazio.
- Esportare il teschio come file stl o tipo di file simile per la stampa 3D.
6. Creazione craniotomia nel modello teschio 3D
- Utilizzando il file MRI del passaggio 5.1, identificare manualmente la posizione approssimativa della craniotomia dai punti di riferimento anatomici trovati nell'atlante cerebrale macaco (ad esempio, solco centrale)19.
- Visualizzare una singola sezione della matrice 3D (simile al passaggio 5.3).
- Scansiona manualmente in avanti o indietro attraverso la matrice 3D fino a quando non si trovano punti di riferimento anatomici riconoscibili.
- Salvare il numero di fotogramma come coordinata z (ad esempio, 3D_Mask(:,:,z)
- Utilizzate uno strumento di selezione dei dati per salvare le coordinate x e y di un singolo punto su questo fotogramma affinché la craniotomia sia centrata sull'utilizzo della funzione Matlab "getpts", con gli ingressi e le uscite [x,y] = getpts. "getpts" apre un'interfaccia utente, fare clic sul frame desiderato (vedere File di codifica supplementare LocateCraniotomy).
- Convertire il raggio della craniotomia prevista da mm a voxel utilizzando le informazioni nell'intestazione DICOM.
- Utilizzando il punto specificato nel passaggio 6.1 come punto centrale, impostare tutti i voxel entro il raggio definito in 6.2 su zero nella maschera dal passaggio 5.8.4 utilizzando il file di codifica supplementare Craniotomy, dove gli input e gli output sono [craniotomyMask] = Craniotomy(mask, x, y, z, radius, X, Y, Z, risoluzione) dove cranitomyMask è una matrice 3D con una craniotomia rimossa, maschera è la matrice 3D iniziale, x,y,z sono le coordinate del punto centrale della craniotomia, raggio è il raggio della craniotomia, X,Y,Z sono vettori di griglia della matrice 3D, e la risoluzione è il raggio definito nel passaggio 6.2 (vedi craniotomia del file di codifica supplementare).
- Per craniotomie multiple, ripetere i passaggi 6.1−6.3 per ogni craniotomia unica.
- Esportare il teschio come file stl o tipo di file simile per la stampa 3D.
7.3D stampa
NOTA: vengono utilizzati due tipi di stampanti 3D per prototipifisici ( Table of Materials). Per le seguenti specifiche, tutte le impostazioni della stampante 3D e del software di stampa devono essere predefinite se non diversamente indicato.
- Per stampare i prototipi e gli stampi, utilizzare una stampante PLA standard (Table of Materials) e creare il G-Code con le seguenti impostazioni stampante e software: densità interna >50% (questo è particolarmente importante per gli stampi in quanto devono contenere liquido), modello di riempimento interno a nido d'ape veloce, modello di riempimento esterno rettilineo, temperatura della piastra = 50 °C e temperatura dell'estrusore = 230 °C.
- Per stampare modelli a fedeltà più elevata del cervello e del cranio utilizzare una stampante di livello industriale per effettuare una stampa combinata di stirene butadiene acrilonitrile (ABS) per il modello e un materiale di supporto dissolubile(Tabella dei materiali). Quindi creare il codice G e con le seguenti impostazioni della stampante: stile di riempimento Sparse - High Density. Tutte le altre impostazioni verranno impostate automaticamente sull'impostazione predefinita appropriata.
- Sciogliere il modello in solvente di supporto( Table of Materials) per ~12 h.
- Dopo aver implementato le impostazioni appropriate della stampante, premere Start e guardare il primo livello della stampa per assicurarsi che il livello di base sia pulito e uniforme.
- Dopo la stampa 3D degli stampi, rattoppare eventuali fori visibili con smalto per unghie(Tavolo dei Materiali)per garantire una tenuta più stretta.
NOTA: I modelli cerebrali e craschi stampati in 3D possono essere combinati inserendo il modello cerebrale nella parte inferiore aperta del cranio. La rimozione dell'anatomia oculare può facilitare il posizionamento del modello cerebrale senza perdere informazioni importanti. Quando viene posizionato all'interno del cranio, il cervello si allinea naturalmente alla posizione anatomicamente corretta.
8. Preparazione dell'agarosio
- Mescolare la polvere di agar(Tabella dei materiali)e la polvere di gomma di carruba(Tabella dei materiali)in un rapporto 1:4 in massa.
- Unire la miscela di polvere con 1 soluzione tamponata con fosfato(Tabella dei materiali)a una soluzione di concentrazione dello 0,6% in un pallone Erlenmeyer.
NOTA: Le concentrazioni utilizzate da altri laboratori si disegnino nello 0,5%-0,6%20,21. - Impostare il microonde sulla massima potenza e posizionare il pallone contenente la soluzione nel microonde per 2 minuti.
- Osservare la soluzione. Quando la soluzione inizia a bollere, arrestare il microonde e il timer, rimuovere il pallone e ruotare vigorosamente. Rilascò il pallone nel microonde e riprenderà il microonde e il timer.
NOTA: Lo scopo è quello di riscaldare la soluzione senza ridurre significativamente il volume a causa dell'evaporazione durante l'ebollizione. - Ripetere il passaggio 8.4 fino al completamento dei due minuti.
- Rimuovere il pallone e mantenere il vortice per evitare che la soluzione si innesta nel pallone.
- Eseguire acqua fredda all'esterno del pallone per raffreddare la soluzione mentre si vorticosa. Raffreddare la soluzione fino a quando l'esterno del pallone non è caldo al tatto, ma tollerabile e sicuro, per evitare che la soluzione deformi lo stampo di plastica nei seguenti passaggi.
- Ruotare il pallone durante il trasporto della soluzione allo stampo per evitare l'indurimento prematuro.
9. Stampaggio di agarosio
NOTA: Il processo di stampaggio dell'agarosio descritto di seguito è lo stesso per l'intero emisfero e gli stampi a metà emisfero superiore
- Versare la soluzione di agarosio in uno degli stampi cerebrali fino al completo. Continuare a ruotare la soluzione rimanente nel pallone.
- Monitorare il livello di soluzione nello stampo per eventuali perdite. Riempire lo stampo se necessario poiché l'agarosio di impostazione sigillerà eventuali perdite nello stampo.
- Lasciare riposare la soluzione nello stampo a temperatura ambiente fino a quando la soluzione non si è impostata e indurita in un solido.
NOTA: Mentre i tempi di attesa possono variare a seconda del volume della soluzione e di altri fattori, 2 ore si trovano in un tempo di attesa affidabile. - Utilizzare una spatola per rimuovere delicatamente il modello di gel dallo stampo. Sii strategico con la posizione dell'inserimento della spatola nello stampo al fine di prevenire potenziali deformazioni alla superficie dello stampo.
- Per rallentare il processo di evaporazione naturale e l'esposizione ad agenti biologici, posizionare il modello di gel in un contenitore sigillato in frigorifero.
10. Iniezione nel modello di gel di agarosio
- Preparare la pompa per l'infusione e fissarla in un braccio stereotassico su un telaio stereotassico(Table of Materials). Posizionare la pompa sulla traiettoria di iniezione corretta e sulla posizione normale alla superficie del modello di gel dalla sezione 9.
- Riempire una siringa da 250 μL(Tabella dei materiali)con acqua DI. Montare la siringa sulla pompa(Tabella dei materiali).
NOTA: Prima di disegnare qualsiasi colorante, l'acqua DI deve riempire completamente la cannula di iniezione(Table of Materials). In questo modo quando il colorante viene redatto attraverso la cannula non c'è compressione o espansione dell'aria da parte dello stantuffo che potrebbe influire sul volume di iniezione. - Utilizzare il driver della pompa (Table of Materials) per ritirare la colorazione degli alimenti ( Table ofMaterials) nella siringa al volume target per l'iniezione. Iniettare lentamente la colorazione del cibo fino a quando non si forma una piccola perla sulla punta della cannula per evitare che le bolle d'aria vengano iniettate nel gel. Asciugare la perla dalla punta della cannula.
- Posizionare il modello di gel sotto la cannula. Abbassare la cannula fino a quando la punta tocca la superficie del modello di gel. Si notano le misure sul braccio stereotassico.
- Abbassare la cannula nel modello di gel rapidamente e senza intoppi alla profondità di iniezione del bersaglio e assicurarsi che la superficie del gel si sia sigillata intorno alla cannula.
- Eseguire la pompa e osservare la diffusione della colorazione del cibo fino a quando il volume di destinazione non viene iniettato. Iniziare con una portata di 1 μL/min e aumentare a 5 μL/min con 1 μL/min passi ogni minuto. La diffusione della colorazione del cibo nel gel è un'approssimazione della diffusione di un vettore virale nel cervello.
- Rimuovere la cannula dal gel in modo rapido e fluido.
- Acquisire immagini della diffusione della colorazione degli alimenti con un dispositivo fotografico (Tabella dei Materiali) e misurare fisicamente le dimensioni dell'embolia per calcolare il volume ellissoide dell'iniezione. Questo approccio è possibile grazie alla natura trasparente del gel.
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Representative Results
La manipolazione e l'analisi delle MRI come misura di pianificazione della craniotomia preoperatoria è stata utilizzata con successo negliultimi 2,5,10,16. Questo processo, tuttavia, è stato notevolmente migliorato dall'aggiunta della modellazione 3D del cervello, del cranio e della craniotomia. Siamo stati in grado di creare con successo un modello fisico anatomicamente accurato del cervello che riflettesse l'area di interesse per i nostri studi (Figura 1). Allo stesso modo siamo stati in grado di creare un modello fisico anatomicamente accurato del cranio del primate estratto dalle immagini MR (Figura 2).
I due modelli fisici del cranio e del cervello combinati con una stretta vestibilità di interferenza, convalidano l'accuratezza dei due modelli l'uno rispetto all'altro e legittimano i dati di analisi della risonanza prima estrapolati(Figura 3A,B). Con il modello combinato siamo stati in grado di inserire una craniotomia nel cranio prima di stampare e visualizzare l'anatomia prevista nella craniotomia (Figura 3). L'accuratezza dell'anatomia prevista nella craniotomia è stata convalidata attraverso un confronto del modello fisico e della craniotomia prevista dall'analisi della risonanza prima (Figura 3B). Inoltre, siamo stati in grado di combinare tutte le parti della nostra interfaccia di esempio e valutare la geometria dei vari componenti in relazione al cranio e al cervello(Figura 3C,D).
Al fine di testare il modello del cranio, è stato estratto un modello fisico del cranio di Monkey L utilizzando i metodi sopra descritti e stampato in 3D per pianificare un intervento chirurgico post impianto della testa. I piedi del palo della testa sono stati quindi manipolati e montati sulla curvatura del cranio nel luogo dell'impianto (Figura 3E). Come risultato del montaggio preoperatorio del palo della testa, il tempo di intervento chirurgico è stato ridotto da circa 2,5 ore a 1 ora (216% più velocemente) dall'apertura all'impianto, riducendo notevolmente il rischio di complicanze operative22.
Manipolando il modello 3D del cervello in SolidWorks, siamo stati in grado di creare uno stampo che riflettesse accuratamente l'anatomia sia del cervello stampato che del modello cerebrale estratto dalla risonanza prima (Figura 4A−C). Questo stampo è stato utilizzato per lanciare un modello di miscela di agarosio del cervello (Figura 4D,E). Utilizzando questi stampi del cervello, siamo stati in grado di iniettare in diverse aree del cervello e stimare il volume dell'infusione di una procedura di iniezione modellata con un colorantegiallo (Tabella dei materiali). Il modello di gel a mezzo emisfero del cervello è stato utilizzato con successo per catturare una visione chiara della diffusione del colorante in un modello di iniezione di virus, permettendoci di misurare un volume approssimativo del colorante nel tempo durante l'iniezione(Figura 5A). L'iniezione di colorante nel modello cerebrale è stata combinata con un cranio stampato in 3D per modellare la chirurgia dell'iniezione vettoriale virale (Figura 5B,C). Questo è stato combinato con un posizionamento dell'array di elettrocorticografia sopra l'iniezione per guidare l'impianto in preparazione perl'intervento chirurgico 7,10.
Figura 1: Modelli del cervello estratto.
(A) Serie stratificata di fette coronali T1-QuickMPRAGE del cervello di Monkey H. (B) Serie stratificata di fette MR del cervello estratto di Monkey H utilizzando il plugin BET e il software Mango come descritto nella sezione Metodi. (C) Vista assiale, sagittale e inclinata di un modello della materia grigia della scimmia H creato utilizzando la funzionalità di costruzione della superficie in Mango. (D) Vista assiale, sagittale e distorta di un modello stampato in 3D della materia grigia di Monkey H creato utilizzando una stampante estrusiva Dremel 3D45. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Estrazione del cranio.
(A) Serie stratificata di fette coronali T1-QuickMPRAGE del cervello della scimmia H. (B) Serie stratificata di maschera binaria dopo semplici fette MR soglia. (C) Serie stratificata di maschera binaria dopo aver rimosso "livello muscolatura". (D) Serie stratificata di maschera binaria del cranio dopo l'elaborazione, come indicato nella sezione Metodi. (E) modello 3D generato da maschera binaria. (F) modello 3D con craniotomia simulata rimossa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Preparazione chirurgica con prototipi stampati in 3D.
(A) Combinazione del cervello stampato in 3D estratto con Mango all'interno di un cranio stampato in 3D estratto dalla risonanza testr dell'IMM della scimmia L, come indicato nella sezione Metodi. (B) Confronto del targeting per craniotomia tra i nostri modelli 3D e pianificazione MR in Monkey L. (C,D) Un esempio di utilizzo della nostra cassetta degli attrezzi per preparare l'impianto a camera (C) e array(D)15. (E) modello stampato in 3D del cranio della scimmia L utilizzato per pre-piegare il poggiacapo prima dell'intervento chirurgico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Modellazione cerebrale in gel.
(A, B) Modello 3D dello stampo per stampi stampati in 3D Monkey H. (C) da A e B. Nella foto a sinistra è uno stampo utilizzato per creare la parte superiore dell'emisfero destro. Nella foto a destra c'è uno stampo per creare i modelli di agarosio dell'emisferodestro (D)della parte superiore dell'emisfero destro (a sinistra) e dell'intero emisfero destro (a destra). (E) Modello di agarosio dell'emisfero destro posto all'interno di una stampa 3D di un cranio estratto dalla scimmia L, a dimostrazione dell'accurata rappresentazione del cervello e della craniotomia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Modellazione a iniezione.
(A) Immagini time lapse della procedura di iniezione. Pre-inserimento del pannello in alto a sinistra. Post-inserimento del pannello in alto a destra. I quattro pannelli inferiori mostrano la diffusione del colorante nel tempo. (B) Modello gel di una sezione del cervello posizionata all'interno di un cranio stampato in 3D con craniotomia tale da poter osservare iniezioni di colorante alimentare in relazione alle strutture corticali e al posizionamento degli elettrodi. (C) stampa 3D di una camera adatta al cranio e osservata in relazione all'array di elettrodi, al modello di gel e all'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codifica supplementari. Clicca qui per scaricare questi file.
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Discussion
Questo articolo descrive una cassetta degli attrezzi per la preparazione per neurochirurgia in NSP utilizzando modelli fisici e CAD di anatomia del cranio e del cervello estratti dalle scansioni MR.
Mentre i modelli di cranio e cervello estratti e stampati in 3D sono stati progettati specificamente per la preparazione di interventi chirurgici craniotomici e post implantazioni della testa, la metodologia si presta a diverse altre applicazioni. Come descritto in precedenza, il modello fisico del cranio consente la pre-flessione del palo della testa prima dell'intervento chirurgico, che crea una buona vestibilità con il cranio. Inoltre, il cranio estratto dalla risonanza teste può essere utilizzato per generare un palo della testa progettato in 3D con una maggiore fedeltà all'anatomia del cranio. Mentre l'imaging CT è tradizionalmente una modalità migliore per l'estrazione del cranio, nel metodo proposto, l'anatomia cerebrale e cranica proviene dalla stessa modalità di imaging, che potrebbe contribuire a una maggiore coerenza anatomica tra i modelli osseo e tessuto molle. Questa coerenza anatomica potrebbe migliorare la precisione e garantire che la craniotomia copra la regione corticale di interesse e che tutti i componenti implantari, come le camere di stimolazione e registrazione, si adattino alla curvatura del cranio. Ciò è supportato da studi esistenti che hanno confrontato quantitativamente la topografia del cranio estratta dalla risonanza magnetica conestrazioni da altri tipi di scansione 23,24. Altri lavori sul campo hanno delineato metodi per la creazione di modelli e prototipi stampati in 3D per la postimpiantodella testa 25,26, ma non utilizzano esclusivamente scansioni MR per creare un modello adattabile per la preparazione sia per la registrazione della testa che per la craniotomia. È importante notare che i parametri di acquisizione della risonanza valutazione utilizzati qui sono fondamentali per l'estrazione del cranio di successo come delineato nel protocollo. Il precedente lavoro nel campo dell'estrazione cerebrale e dello stripping del cranio offre alternative all'estrazione cerebrale BET ampiamente disponibile utilizzata in questo protocollo27. Allo stesso modo, esistono script personalizzati per l'estrazione del cranio, tuttavia, richiedono la rimozione manuale di voxel non teschio rispetto a un protocollocompletamente automatizzato 28. Mentre qui mostriamo solo alcuni esempi, questi strumenti sono applicabili a una varietà di altri interventi chirurgici come elettrodi e impianti a camera in NSP2,4,5,7,10,15,18,29,30,così come altri modelli animali31,32.
Se combinato con i modelli cerebrali della miscela di agarosio, la cassetta degli attrezzi per la preparazione chirurgica può essere applicata per preparare procedure chirurgiche che coinvolgono iniezioni di liquidi come optogenetica e chemiogenetica2,4,5,10,33,34. Anche se qui abbiamo avuto successo nell'utilizzare PLA per stampare in 3D gli stampi, questo processo può essere ulteriormente migliorato utilizzando un filamento ABS, che ha una temperatura di transizione del vetro più elevata che renderà il processo di stampaggio più efficiente. Il lavoro precedente ha proposto il gel di agarosio come materiale artificiale in grado di imitare alcune delle proprietà meccaniche del cervello rilevanti per l'infusione diliquidi 20,21. Tuttavia, il lavoro precedente non ha combinato l'agarosio con uno stampo realistico per fornire uno strumento di preparazione chirurgica. Il cervello in gel miscela di agarosio modellato può essere utilizzato per dare un contesto corticale qualitativo alla posizione di iniezione e visualizzare il volume e la posizione della diffusione del fluido. Il cervello gel può anche essere utilizzato per praticare il movimento di iniezione e la posizione all'interno del telaio stereotassico. Questo può essere applicato non solo all'optogenetica, ma tradotto in altri esperimenti che richiedonol'iniezione nel cervello 2,4,34. Il modello può anche essere utilizzato per migliorare l'attuale pratica standard CED ottimizzando la velocità di iniezione e lo spessore della cannula. Questo modello può anche essere rafforzato dalla convalida quantitativa della miscela di gel di agarosio per rappresentare accuratamente il flusso diffusivo e convettivo nelcervello 5,10. Negli sforzi futuri possiamo anche incorporare le informazioni sulla vascucolatura nei nostri modelli 3D includendo l'imaging migliorato a contrasto nella nostra procedura di imaging in grado di fornire informazioni critiche sulla pianificazione dell'iniezione.
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Disclosures
Al momento gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dall'Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & Human Development dei National Institutes of Health con il numero di premio K12HD073945, dal Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), dal Center for Neurotechnology (CNT, un National Science Foundation Engineering Research Center sotto Grant EEC-1028725) e dai Fondi di ricerca sulla royalty dell'Università di Washington. I finanziamenti ai laboratori Macknik e Martinez-Conde per questo progetto provenivano da un BRAIN Initiative NSF-NCS Award 1734887, così come dai NSF Awards 1523614 & 1829474 e dalle borse di studio SUNY Empire Innovator per ogni professore. Ringraziamo Karam Khateeb per il suo aiuto nella preparazione dell'agarosio e Toni J Huan per l'aiuto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printing Software (GrabCAD Print) | Stratasys | Version 1.36 | Used for High quality 3D printing |
| 3D Printing Software (Simplify 3D) | Simplify3D | Version 4.1 | Used for PLA 3D printing |
| Agarose | Benchmark Scientific | A1700 | Used for making gel brains |
| Black Nail Polish | L.A. Colors | CNP637 | Used for gel molding |
| Cannula (ID 450 um, OD 666 um) | Polymicro Technologies | 1068150625 | Used to inject dye into gel brain |
| Catheter Connector | B Braun | PCC2000 | Perifix for 20-24 Gage epidural catheters; Units per Cs 50 |
| Dremel 3D Digilab 3D45 printer | Dremel | F0133D45AA | Used for prototyping in PLA |
| ECOWORKS | Stratasys | 300-00104 | Used to dissolve QSR support structures |
| Erlymeyer flask | Pyrex | 4980 | Used for gel molding |
| Ethyl cyanoacrylate | The Original Super Glue Corp. | 15187 | Used to make combined cannula |
| Graduated cylinder | 3023 | Used for gel molding | |
| HATCHBOX PLA 3D Printer Filament | HATCHBOX | 3DPLA-1KG1.75-RED/3DPLA-1KG1.75-BLACK | 1kg Spool, 1.75mm, Red/Black |
| Locust Bean Gum | Modernist Pantry | 1018 | Gumming agent for gel brain mixtures |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Used for skull extraction |
| McCormick Yellow Food Color | McCormick | Used for dye injection | |
| Microwave | Panasonic | NN-SD975S | Used for agarose curing |
| MR Imaging Software (3D Slicer) | 3D Slicer | Version 4.10.2 | Used for 3D model generation |
| MR Imaging Software (Mango with BET plugin) | Reasearch Imaging Institute | Version 4.1 | Used for brain extraction |
| Philips Acheiva MRI System | Philips | 4522 991 19391 | Used to image non-human primates |
| Phosphate Buffered Solution | Gibco | 70011-044 | 10X diluted with DI water to 1X |
| Pump | WPI | UMP3T-1 | Used for dye injection |
| Pump driver | WPI | UMP3T-1 | Used for dye injection |
| Refrigerator | General Electric | Used to preserve agarose gel | |
| Scientific Spatula | VWR | 82027-494 | Used to extract gel molds |
| SolidWorks | Dassault Systemes | 2019 | |
| Stratasys ABS-M30 filament | Stratasys | 333-60304 | Used for high quality 3D printing |
| Stratasys F170 3D printer | Stratasys | 123-10000 | Used for high quality 3D printing |
| Stratasys QSR support | Stratasys | 333-63500 | Used to create supports with ABS model |
| Syringe | SGE | SGE250TLL | Used for dye injection |
References
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