Summary
En protokol præsenteres kombinere væv clearing med lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM) for at opnå tre-dimensionelle og cellulære opløsning billeder af lymfekar og lymfeknuder (LNs) indsamle cerebrospinalvæske (CSF) og spinal epidural væske.
Abstract
Lymfesystemet forbundet med centralnervesystemet (CNS) omfatter lymfe vaskulatur, der spinder rundt i hjernen, rygmarven, og dens tilknyttede LNs. CNS-associeret lymfesystemet er involveret i dræning af CSF makromolekyler og meningeal immunceller mod CNS-drænende LNs, og dermed regulere affald clearance og immunovervågning i CNS væv. Præsenteret er en ny tilgang til at opnå tre-dimensionelle (3D) og cellulære opløsning billeder af CNS-associerede lymfeknuder og samtidig bevare integriteten af deres kredsløb i det omgivende væv. iDISCO+-protokollen anvendes til immunmærkelymfekar i afkalkede og ryddede hele monteringspræparaterne af rygsøjlen, som efterfølgende afbildes med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM). Teknikken afslører 3D-strukturen af lymfenetværket, der forbinder meningeal og epidural rum omkring rygmarven til extravertebral lymfekar. Forudsat er 3D-billeder af dræning kredsløb af molekylære sporstoffer tidligere injiceres i enten CSF via cisterna magna eller thoracolumbar spinal parenkym. IDISCO+/LSFM-tilgangen giver hidtil usete muligheder for at udforske strukturen og funktionen af det CNS-associerede lymfesystem i neurovaskulær biologi, neuroimmunologi, hjerne- og ryghvirvlingekræft eller vertebrale knogler og ledbiologi.
Introduction
CNS er omgivet af CSF og overliggende lag af meninges, epidural væv, og knogler. Alt i alt giver CSF fysisk beskyttelse til den bløde hjerne og rygmarv. Det er hovedsageligt udskilles af choroid plexus og meningeal membraner (dvs. pia mater, arachnoid, og dura mater). CSF-meningeal-komplekset etablerer også en funktionel grænseflade mellem CNS-væv og resten af kroppen og bidrager dermed til CNS-homøostase. For det første, CSFtrænger CNS parenkym gennem CNS para-arterielle rum og interagerer dynamisk med den interstitielle væske (ISF) 1 via glymphatic (glialymfe) system, som består af paravascular rum og astrocyt end-feet membraner omkring CNS fartøjer2,,3,4. Metabolisk affald og overskydende væske er derefter i sidste ende ryddet af intramural perivascular dræning direkte fra hjernen parenkym mod den systemiskecirkulation 3, samt de paravenøse rum mod CSF og via hjerne-drænende lymfekar, i henhold til glymphatic model2,4. CSF-udstrømningen sker hovedsagelig via lymfesystemet gennem krympepladen og tilhørende ekstrakraniskelymfekar 5,6,7samt af de meningeale lymfekar, der konvergerer ved de hjernedrænende LNs8,9,10,11,12 (Figur 1). En vigtig, selv om sekundær, rolle i CSF udstrømning er taget af kraniel arachnoid villi, som trænger ind i lakunen af meningeal venøse bihuler13.
CFS-dræningskredsløbene er blevet grundigt undersøgt gennem eksperimentelle tilgange baseret på injektion af farvede/fluorescerende lymstoffer i CNS eller CSF, efterfulgt af billeddannelse af sporstoffers mønster inde i CNS og i hele kroppens organer og væv på forskellige tidspunkter efter injektion13. I lang tid, udstrømningen af CSF blev anset for at være udelukkende og direkte taget ansvaret af blodcirkulationen, gennem arachnoid villi projicere i dural venøse bihuler13. Csf udstrømningen udføres dog overvejende af lymfevaskulaturen, som det for nylig fremgår af nær-infrarød (NIR) dynamisk billeddannelse af CSF-injiceret sporstoftransport i mus9,10. CSF-drænende lymfekar derefter vende tilbage lymfeknuder til blodbanen via højre subclavia vene. Komplementære approches har opdaget både ekstrakranial6,,7,,13 og intrakraniel9,,10,,11,,12 lymfeudgange af CSF-injicerede sporstoffer og tyder på, at CSF absorberes af to lymfeveje, den ene eksterne og den anden interne til rygsøjlen og rygsøjlen. Den vigtigste del af CSF dræning hurtigt opstår gennem lymfekar placeret rostrally, uden for kraniet i næseslimhinden, gennem kanaler af cribriform plade af ethmoidknoglen 3,6,13 og, caudally, uden for lumbosacral vertebrale knogler gennem dorsolaterale ruter, der endnu ikke er fuldt karakteriseret7,14. Desuden, i meninges af kraniet, lymfe kapillærer af dura mater directy absorbere CSF og meningeal immunceller mod dural lymfesamlere, der krydser kraniet knogler og forbinde til CNS-drænende LNs12,14. Disse meningeal lymfekar spiller vigtige roller i CNS patofysiologi, fordi hjernen meningeal lymfe er ændret ved aldring og også påvirke resultatet af neurologiske hjernesygdomme, herunder neurodegeneration, neuroinflammation, og hjernekræft15,16,17. Derfor kan CNS-associeret lymfevaskulatur (dvs. dural og perifere lymfekar dræne CSF) være et lovende nyt mål for at bekæmpe CNS-sygdomme hos mennesker.
Konvergerende undersøgelser udført med immunohistologi og højopløsningsmagdannelse af magnetisk resonans viste, at meningeal lymfekonfekturen også findes hos primater, herunder almindelige marmoseaber og mennesker7,11,13. Desuden meningeal lymfekar er ikke begrænset til kraniet, men strækker sig inden for rygsøjlen til overfladen af spinal ganglier og rami13,18. Tre-dimensionelle (3D) billeddannelse af rygsøjlen lymfeknuder bevare den overordnede anatomi af mærket vertebrale og spinal prøver, herunder overliggende knogler, muskler, ledbånd, samt tilstødende viscerale væv, blev for nylig udført14. iDISCO+ protokol19,20 blev anvendt til at afkalke og rense præparater af hele rygsøjlen med lymfespecifikke antistoffer mod enten membranreceptoren LYVE121 eller transskriptionsfaktoren PROX122. Billederhvervelse og analyse blev derefter udført med lysark fluorescensmikroskopi (LSFM) og Imaris software. LSFM giver mulighed for hurtig og minimalt invasiv 3D-billeddannelse af store prøver ved aksial indeslutning af belysning, hvilket resulterer i reduceret fotobleaching og fototoksicitet23.
IDISCO+/LSFM tilgang giver karakterisering af de forskellige lag af dural og epidural lymfekar, og forbindelsen af denne vaskulatur til extravertebral lymfekredsløb og LNs tilstødende rygsøjlen. Protokollen blev anvendt på væv, der tidligere blev injiceret med fluorescerende sporstoffer for at påvise dræning af rygsøjlen. Dette papir indeholder oplysninger om iDISCO+/ LSFM metode til billede af vertebrale lymfedrænulatur og illustrerer dens relevans for CSF og epidural væske dræning undersøgelse.
Protocol
Alle in vivo-procedurer, der anvendes i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med alle relevante etiske bestemmelser for dyreforsøg og -forskning i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskab for retningslinjer for forsøgsbrug (L358-86/609EEC). Undersøgelsen fik etisk godkendelse fra INSERM's Etiske Komité (n°2016110111126651) og ICM's udvalg for institutionsdyrepleje og -anvendelse (Institut du Cerveau et de la Moelle épinière).
1. Forberedelse
- Forbered følgende dissektion værktøjer til kirurgi: skalpel (1), microforceps (2), forrektriver (1), dissektion saks, og Michel sutur klip. Der tilberedes 26 G-nåle (0,45 mm x 13 mm), 1 ml sprøjte og 10 μL mikrosyring.
- Mikrokaprik med en ettrinsprotokol ved 67,5 °C med en mikropipettetræker af glas. Forbered to mikrokapillærer pr injektion.
- Reagenser til billeddannelse lymfedrænage (Tabel 1):Ovalbumin Alexa Fluor 555 konjugat (OVA-A555, 2 mg/ml i 1x fosfat bufferet saltvand [PBS]) og anti-LYVE1 antistof (1 mg/ml i 1x PBS).
- Der klargør antistoffer (tabel 1) til iDISCO+. Ved primære antistoffer anvendes anti-LYVE1 kaninpolyklonalt antistof (1:1.600) og anti-PROX1 gedepolyklonalt IgG-antistof (1:2.000). For sekundære antistoffer, bruge Alexa Fluor æsel anti-kanin-568, æsel anti-kanin-647, og æsel anti-ged-647 (1:2,000).
2. Kirurgiske indgreb for intra-cisterna magna (ICM) og thoracolumbar (ThLb) injektioner
- Forberedelse af dyret til kirurgi
- Brug voksne han- og hun-C57BL6/J-mus, 8-12 uger gamle.
- Musinperitonealt (IP) injiceres med 0,015 mg/ml buprenorphinopløsning fortyndet i 0,9% natriumchlorid ved 0,1 mg/kg, 15 min før operationen.
- Bedøve musen i en induktion boks med 2-3% isofluran gas.
- Fremstilling af bedøvet dyr til indsprøjtning af sporstoffer
- Anbring den bedøvede mus og dens varmepude på det stereotaxiske apparat. Brug ørestænger til at holde musens hoved, og fastsætte kroppen i en ~ 135 ° vinkel til hovedet eller immobilisere rygmarven på ThLb vertebrale niveau (Th12-L1) med en spinal adapter. Klem halen eller poten med kraften for at kontrollere effektiviteten af anæstesi.
- IP 200 μL på 0,9 % natriumchlorid indsprøjtes til hydrering af mus.
- Ved hjælp af en skalpel klinge, foretage en hud snit, enten i occipital regionen mod livmoderhalskræft region for ICM injektion, eller på ThLb vertebrale niveau (Th10-L3) til injektion i ThLb spinal parenkym.
- Indsprøjtning af sporstoffer
- Kassér paracervikale og paraspinale muskler, der dækker halsen og kolonnen for at visualisere overfladen af dura mater, det yderste lag af meninges.
- Punktformet forsigtigt det centrale område af dura mater og underlag arachnoid med en 26 G nål.
- Mikrokaprisk implantation
- Skær 2 mm af glaskapillær spidsen (se trin 1.2), og brug derefter mikrokapillæren, der er forbundet med en kanyle, der er forbundet med en 10 μL sprøjte, til at aspirere 2-8 μL af OVA-A555 eller LYVE1-antistoffet.
- Mikrokapillæren indføres i dura-materens mediale område i en vinkel på 30° for ICM-injektioner eller 10° vinkel for ThLb-ryginjektioner, og skub den ind til 1,5 mm under duramüren.
BEMÆRK: Ledbåndet er punkteret, men der udføres ingen laminectomy. - Tilsæt 10 μL kirurgisk lim for at lukke snittet omkring glaskapillæren og vent på, at det tørrer.
- Injicer langsomt fluorescerende sporstof ved 1 μL/min. Når injektionsvolumenet er leveret, skal kapillæren fastholdes i 1 min. Træk mikrokapillæren tilbage og tilsæt kirurgisk lim for at lukke injektionshullet.
- Postinjektion, lukke huden indsnit med sutur klip. Fjern musen fra det stereotaxiske apparat, og placer den i et postsurgeryopvarmningskammer ved 37 °C, indtil den kommer sig.
3. Perfusion og vævsdissektion
- Ved enten 15 min eller 45 min efter injektion af CSF-sporstof skal IP injiceres en dødelig dosis (100 μL) natriumpentobarbital. Klem halen eller poten for at kontrollere, at der ikke er nogen refleks.
- Med dissektion saks, skære huden og åbne bughindelaget fra underlivet regionen mod brystkassen. Åbn brystkassen med en saks for at få adgang til hjertet.
- Sæt 26 G-nålen i hjertets venstre ventrikel og begynd at gennemgå med 20 ml iskold 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS ved 2 ml/min. Brug saks til hurtigt at skære den rigtige atrium og frigive perfusion væske strøm.
- Fjern huden helt med sænker og skær de fire ben med en saks. Fjern alle de indre organer, men vær omhyggelig med at bevare NE intakt.
BEMÆRK: Mandibulære LNs er overfladiske, så pas på ikke at fjerne dem, når du skærer huden af. Deep-cervikale LNs (dcLNs) er placeret på hver side af luftrøret, i kontakt med den laterale overflade af de interne halspulsårer og tæt på stereomastoid muskler. - Skær ribbenene for at fjerne rygsøjlen med rygmarven inde fra livmoderhalsen til lændesegmenterne.
- Det dissekerede væv nedsænkes i iskold 4% PFA i 1x PBS i et 50 ml rør natten over (~18 h) ved 4 °C. Det faste væv vaskes 3x i 50 ml 1x PBS i 5 min.
4. Fluorescensmasoskopi af et vertebrale segment
- Prøven anbringes under fluorescenssterzoommikroskopet med et kamera (Materialetabel). Få en oversigt over eksemplet, eller zoom på et bestemt område.
5. Prøveforberedelse til hele monteringsimmunosting
- Ved hjælp af en mikrotomklinge skæres hoved- og rygsøjlen på det occipitale og cervikale niveau på tværs.
BEMÆRK: Denne dissektion tillader isolering af hovedet og halshvirvelsøjlen fra resten af rygsøjlen. - Med en mikrotomklinge skæres hals-, brystkasse- og sakrale områder af rygsøjlen på tværs i segmenter af 2−4 ryghvirvler, ca. 0,5 cm størrelse hver.
- Isoler hvert segment i den rækkefølge, det blev adskilt fra rygsøjlen, langs hele længden af hals- og brystområderne i rygsøjlen. Hver prøve opbevares i et rør på 2 ml 1x PBS.
6. iDISCO+ hele mount immunostaining af et vertebrale segment
BEMÆRK: Den detaljerede beskrivelse af iDISCO+ protokollen er tilgængelig på http://www.idisco.info.
- Dag 1: Vævsdehydrering
- Dehydrer vertebrale vævsprøver (dvs. et vertebrale segment) ved successive nedsænkning i 20%, 40%, 60%, 80% og 100% methanol i 1x PBS i 1 time med agitation.
- Prokuber prøverne natten over i en opløsning på 33% methanol/66% dichlormethan (DCM) ved stuetemperatur (RT) med omrøring.
- Dag 2: Væv blegning
- Prøverne 2x med 100% methanol i 1 time ved RT. Inkuber prøverne i 5% H2O2 i methanol (30% H2O2 og methanol 1:5 v/v) ved 4 °C natten over.
- Dag 3: Afkalkning og gennemkalkning trin
- Rehydrere prøverne gradvist i 80%, 60%, 40%, 20% methanol, derefter i 1x PBS (1 time i hver opløsning) ved RT med omrøring.
- Afkalke ryghvirvlerne ved at inkubere prøver i Morses opløsning (10% trinatriumcitrat og 45% myresyre 1:1 v/v) i 30 min ved RT for at bevare knoglestrukturen.
- Prøverne 2x med 1x PBS og inkuber 2x i 1 time i PTx2 opløsning (0,2% Triton X-100 i 1x PBS, fornys til den anden inkubation) ved RT ved omrøring. Derefter inkuberes de forbehandlede prøver i permeabiliseringsopløsning (PTx2 med 20% dimethylsulfoxid [DMSO] og 2,3% w/v glycin) ved 37 °C i 24 timer.
- Dag 4: Blokeringstrin
- Inkuber prøver i blokerende opløsning (PTx2 med 6% æsel serum og 10% DMSO) ved 37 °C i 24 timer.
- Dag 5−16: Immunmærkning af hele monteringen
- Inkuber prøver i primærantistof fortyndet i PTwH (1x PBS indeholdende 0,2% Tween-20 og 0,1% heparin ved 10 mg/ml i 1x PBS) med 5% DMSO/3% æsel serum ved 37 °C i 6 dage. Prøverne 4−5x vaskes i PTwH ved RT ved omrøring natten over.
- Inkuber prøver i sekundære antistoffortyndinger i PTwH med 3% æselserum ved 37 °C i 4 dage. Prøverne vaskes i PTwH 4−5x ved RT under omrøring natten før rydning.
- Dag 17 og 18: iDISCO+ vævsclearing
- Dehydrer prøverne gradvist ved successive nedsænkning i 1x PBS, derefter 20%, 40%, 60%, 80% og 2x i 100% methanol (1 time i hver opløsning). Hver prøve hældes natten over i en opløsning på 33 % methanol/66 % DCM.
- Vask 2x i 100% DCM i 15 min for at fjerne methanol. Inkuberes i dibenzylæther (DBE) uden at ryste, indtil det er ryddet (4 timer), og opbes derefter i DBE ved RT, før du afbildning.
7. LSFM billeddannelse
- Billede ryddet prøver i et tværgående plan med LSFM udstyret med en 4x/0.3 mål.
- Brug en enkeltsidet belysningskonfiguration med tre ark, fast x-position (ingen dynamisk fokusering). Brug LED lasere indstillet til 561 nm, 100 mW; og 639 nm, 70 mW. Indstil den numeriske blændeåbning på lysarket til 30 %.
- Brug forskellige emissionsfiltre: 595/40 til Alexa Fluor-568 eller -555 og -680/30 for Alexa Fluor-647.
- Fyld mikroskopkammeret med DBE.
- Aquire stakke med 2,5 μm z trin og en 30 ms eksponeringstid per trin med kameraet(Tabel af Materialer). Brug x2 optisk zoom til en effektiv forstørrelse på (x8), 0,8 μm/pixel, og udfør mosaikanegelserne med en overlapning på 10 % på full frame.
- Hent billeder i .tif-format med anskaffelsessoftware, og konverter dem til 3D-format med en filkonverteringssoftware.
- Rekonstruere mosaikker erhvervelse med stitcher software( Tabel af Materialer). Åbn billederne, og flyt manuelt for at rekonstituere hele mosaikbilledet ved hjælp af overlapningen på 10 % mellem billederne som retningslinje.
- Brug 3D-softwaren (Materialetabel) til at generere ortogonale dataprojektioner, som vist i figur 1, Figur 2, Figur 3og Figur 4, og tilføj en farvekodeattribut til lymfekar og andre anatomiske strukturer på displayet. Angiv en gammakorrektion på 1,47 til de rådata, der er indhentet fra LSFM i henhold til fabrikantens anvisninger.
Representative Results
3D-billeddannelse af vertebrale lymfevaskulatur
Figur 1 viser trinene i iDISCO+/LSFM-proceduren og et LSFM-billede af lymfekredsløb inde i ryghvirvlerne i iDISCO+-behandlede ThLb ryghvirvler. Kombinationen af iDISCO+ med LSFM bevarede vertebrale anatomi og fanget en visning af lymfemarkedet vaskulære netværk (dvs. de intravertebrale fartøjer forbundet med extravertebral fartøjer spændende dorsally og lateralt fra vertebrale kroppen) inden for de omkringliggende knogler, ledbånd, muskler, og nerve ganglier.
Fluorescensmasoskopi af dcLN-dræning
For at afbilde makromolekyle dræning i CNS-associeret lymfesystemet, makromolekylære sporstoffer blev administreret in vivo ved injektion i enten CSF eller spinal parenkym. En makromolekylær sporstof kan let leveres i CSF på cisterna magna. Den cisterna magna er placeret mellem lillehjernen og dorsale overfladen af medulla oblongata, over foramen magnum. Makromolekylære sporstof kan også injiceres i spinal parenkym ved stereotaktisk kirurgi på forskellige niveauer langs rygsøjlen.
De anvendte makromolekylære tracers var enten direkte mærket med en fluorophore eller opdaget postmortem ved immunohistochemistry med specifikke antistoffer. Figur 2A illustrerer forsøgsplanen for sporing af OVA-A555, en rød lysstofrør og et lille sporstof af molekylvægt (ca. 45 kDa), som blev injiceret i enten CSF(Figur 2B) eller ThLb-regionen i rygmarven (Figur 2C).
Ved 45 min efter den makromolekylære sporstofinjektion blev musene ofret, perfunderet med 4% PFA og forarbejdet til at isolere dissekrete segmenter af hovedets hjernestammeområde og rygsøjlen, der blev afkalket og afklaret. Makromolekyle dræning blev derefter let vurderes ved fluorescens makroskopi af de LNs, der indsamler CSF og epidural væsker. Som vist i figur 2resulterede OVA-A555-injektion i enten CSF (Figur 2B) eller rygmarvens thlb (figur 2C-region i rygmarven i OVA-A555 i dcLN'erne efter injektionen. Denne observation indikerer optagelse og dræning af fluorescerende sporstof af lymfesystemet; det er en forudsætning, før du forfølger iDISCO+/ LSFM procedure til billede af vertebrale lymfedrænage.
3D-billeddannelse af makromolekyledræning i vertebrale lymfesystemet
Baseret på påvisning af OVA-A555 mærkning i dcLNs, iDISCO+/ LSFM procedure kunne anvendes på afkalkede og precleared vertebrale prøver isoleret fra OVA-A555-injiceredemus. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at oprette et 3D-kort over lymfedrænage af CSF og spinal epidural væske på et bestemt tidspunkt efter sporstof injektion. Denne 3D-kortlægning kan udføres ved at billeddanne flere CNS-segmenter på hvert niveau af rygsøjlen fra injektionspunktet.
Figur 3A viser det eksperimentelle design for OVA-A555 injektion i ThLb spinal parenkym og det deraf følgende 3D-mønster af OVA-A555-fordeling i et cervikalt og et thorax vertebrale segment sammen med lymfeløjf. Ved 45 min efter OVA-A555 injektion, OVA-A555 ophobning blev påvist i rygmarvsvæv og dcLNs (hvide pile i figur 3B),efter aftale med mikroskop observationer illustreret i figur 2. Det blev dog ikke påvist i livmoderhalskræft og thorax lymfe vaskulatur mærket med anti-LYVE1 antistoffer. Fraværet af CSF-indsprøjtet sporstof i lymfekarret kan skyldes enten en kort persistenstid for sporstof i lymfekar eller manglende optagelse af sporstof fra lymfekar (Figur 3C).
For at teste den første hypotese, kanin anti-LYVE1 antistof blev brugt som en lymfecelle tag til at binde CNS-associerede lymfekar. Det injicerede kaninanti-LYVE1 antistof blev derefter påvist ved immunhistokkemi med et sekundært antikaninantistof, mens lymfeenotheliale celler blev immunmærket med anti-PROX1 antistoffer. Figur 4 repræsenterer det eksperimentelle design af anti-LYVE1-injektion i ThLb spinal parenkym (Figur 4A) og det deraf følgende 3D-fordelingsmønster af LYVE1-antistoffer i et ThLb-segment tæt på injektionsstedet med hensyn til PROX1+ lymfeknuder (Figur 4B). Både vertebrale lymfe og deres extravertebral lymfeforbindelser blev mærket af injicerede anti-LYVE1 antistoffer, som underbyggede sporstofoptagelsen af vertebrale lymfekar og lymfedrænage mod det ekstravertebral lymfesystem. Der manglede LNs i ThLb-regionen og kunne derfor ikke visualiseres i det afbildede segment. Endvidere afspejlede det diskontinuerlige mønster af LYVE1-markør, der blev observeret langs lymfekar, sandsynligvis det diskontinuerlige udtryk for LYVE1 i lymfevaskulaturen, som rapporteret i tidligereundersøgelser 14,21. Alt i alt viste resultaterne af denne undersøgelse, at ved 45 min efter indsprøjtning af sporstoffer, LYVE1 antistof, men ikke OVA-A555, tilladt påvisning af lokale vertebrale lymfeoptagelse og var preferrable til OVA-A555 som en vedvarende markør for lokale vertebrale lymfedrænage.
Figur 1: Tredimensionelt syn på vertebrale lymfevaskulatur. aA) Skematisk repræsentation af protokollen. (B)Planar projektion af en 3D-visning af ThLb vertebrale lymfe vaskulatur fra en dorsofrontal perspektiv. Lymfekar blev immunmærket med anti-PROX1 antistof (grøn) ved hjælp af iDISCO+ protokollen og derefter afbildet af LSFM. Bemærk det metameriske-lignende mønster af vaskulaturen i ryghvirvlinge på tre på hinanden følgende ryghvirvler (hvide pilespidser). Ud over halvcirkelformede rygbeholdere (hvide pilespidser) omfattede hvert vertebrale netværk ventrale grene (gule pile), bilaterale laterale udgangsveje langs spinal rami og ganglier (hvide pile) samt en dorsal udgangsrute ved midterlinjen (hvid dobbeltpil). Vertebrale netværk var forbundet med en langsgående fartøj (lilla pile). For en komplet beskrivelse, se Jacob L. et al.18 SC = rygmarv; Stjerne = ventral vertebrale krop; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skalabarer = 300 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dcLNs indsamlet OVA-A555-mærketCSF Væsker. AA) Ordningen for forsøgsdesignet. OVA-A555 blev injiceret i enten ICM eller ThLb spinal parenkym, derefter mus blev ofret 45 min efter injektion. Prøverne blev ryddet og observeret ved fluorescensmakroscope-billeddannelse (B,C). Fluorescensmaoskop billeder af halshvirvler fra ICM- (B) og ThLb- (C) injiceres mus. Bemærk, at OVA-A555 akkumuleret i dcLNs (B,C,hvide pilespidser), pial og paravascular rum i halshals rygmarven (B,C) og efter ICM injektion, i ventrolateral udgange ruter, sandsynligvis langs halsløse nerver (B, hvide pile). SC = rygmarv. Stjerne = ventral vertebrale krop; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skalastænger i B og C = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Påvisning af OVA-A555-mærketCSF-væsker i vertebrale lymfesystemet. AA) Ordningen for forsøgsdesignet. OVA-A555 blev injiceret i ThLb spinal parenkym, derefter mus blev ofret ved 45 min efter injektion. Prøverne blev behandlet med iDISCO+ protokollen og afbildet med en LSFM. bB,c) Planar fremskrivninger af LSFM-fanget frontal 3D visninger af livmoderhalskræft (B) og thorax (C) rygsøjlen segmenter. OVA-A555 akkumulering (rød) blev påvist i rygmarvsvæv og dcLNs (B, hvid pil), som vist i figur 2, men ikke i livmoderhalskræft og thorax lymfe vaskulatur immunmærket her med anti-LYVE1 antistoffer (grøn). SC = rygmarv; Stjerne = ventral vertebrale krop; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skalastænger = 1 mm (B), 300 μm (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Påvisning af dræning af vertebrale lymfedrænager efter intraspinal injektion af anti-LYVE1 antistoffer. AA) Ordningen for forsøgsdesignet. Anti-LYVE1 antistoffer blev injiceret i ThLb spinal parenkym, derefter mus blev ofret 45 min efter injektion. Prøverne blev behandlet med iDISCO+ protokollen og afbildet med en LSFM. (B). Planar fremskrivninger af frontal 3D visninger af en ThLb (B) rygsøjlen segment, fanget med en LSFM. Anti-LYVE1 antistoffer blev påvist med anti-kanin antistoffer (lilla) og lymfe vaskulatur med anti-PROX1 antistoffer (grøn). Hvide kar er PROX1 + lymfeko mærket med anti-LYVE1 antistoffer (B);+ disse omfatter vertebrale (gule pile) og extravertebral (dobbelt gule pile) lymfeknuder. SC = rygmarv; Stjerne = ventral vertebrale krop; D = dorsal; L = lateral; V = ventral; Skalastænger = 300 μm (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagenser | Mål | Figur | Protokoltrin | Kommentar |
| OVA-A555 | CSF-sporingsstof | Figur 2 og Figur 3 | 2. ICM eller ThLb injektion 7. LSFM billeddannelse. |
Vandopløseligt, let at injicere og høj intens fluorescens |
| Anti-Lyve1 antistof | Membranmarkør for LVs-celler | Figur 3 | 6. iDISCO+ hel montering immnunostaining. 7. LSFM billeddannelse. |
Effektivt antistof til hele montere immnunostaining |
| Tracer dræning af dural og epidural LVs | Figur 4 | 2. ICM eller ThLb injektion 6. iDISCO+ hele mount immnunostaining 7. LSFM billeddannelse |
||
| Anti-Prox1 antistof | Nuklear markør for LVs-celler | Figur 1 og Figur 4 | 6. iDISCO+ hele mount immnunostaining 7. LSFM billeddannelse |
Effektivt antistof til hele montere immnunostaining |
Tabel 1: Antistoffer og tracer, der anvendes i undersøgelsen.
| Problem | Mulig årsag | Løsning | |
| Kirurgi for sporstof injektion | Uønsket CNS-vævslæsion | 1. Manglende kontrol over indføring af glaskapillær indføring 2. Forkert dybde af glas kapillær indsættelse |
1. Punktformet med omhu, men fuldt ud, dura mater med en 26 G nål før glas kapillær indsættelse. 2. Reducer glaskapillær indsættelses deepness (<1,5 mm fra dura mater). 3. Reducer glaskapillær diameter. |
| Uønsket besmittelse af indsprøjtet sporstof i epidural eller ekstra ryggrøde | Forkert injektion af sporstof | 1. Kontroller, om glasmikrokapillæren er blevet godt indsat i punktformøren duramåberen. 2. Tilsæt kirurgisk lim mellem glasmikrokapillær og det omgivet væv, før der injiceres sporstof. |
|
| For stor mængde indsprøjtet sporstof | Reducer mængden af injiceret sporstof (<2 μL). | ||
| iDISCO+ immunstaining | Fravær, heterogenitet eller overdreven baggrund af mærkning i vævet | 1. Problemer med koncentrationen af det primære antistof 2. Utilstrækkelig permeabilisering 3. Utilstrækkelig vask 4. Utilstrækkelig clearing |
Øge antallet og/eller tidspunktet for inkubationstrin: permebilisering, hvæssning, primært antistof og rydning. Se http://www.idisco.info (Ofte stillede spørgsmål og fejlfinding). |
| Utilstrækkelig afkalkning | Brug en strengere afkalkningsbehandling af prøve med EDTA21- eller Morseopløsning til især hovedvæv. | ||
| iDISCO+ clearing | Prøverne er uigennemsigtige eller brunfarvede | Utilstrækkelig blegning | Brug frisk H2O2 opløsning, øge volumen og / eller inkubationstid. |
| Tilstedeværelse af oxidation | Fyld røret helt for at undgå tilstedeværelsen af luft. | ||
| Utilstrækkelig clearing | Forøg volumen og/eller inkubationstiden. Se http://www.idisco.info (Ofte stillede spørgsmål og fejlfinding). | ||
| Registrering af sporing af sporstoffer | Spores ikke kan spores | Forkert kombination af den valgte sporingsstof | Alexa 555, 594 og 647 fluorochromes er resistente over for iDISCO+ protokol5,6,,7,,8,9,10. Dette er imidlertid ikke tilfældet for FITC, GFP, RFP fluorochromes. |
| Sacrifice tidspunkt efter injektion | Foretrækker OVA-A555 for kortsigtede (15 min) dræning analyse i lokale vertebrale lymfeknuder. For lymfeknuder dræning analyse, OVA-A555 og Lyve1 antistof kan anvendes til længere sigt (> 45 min) analyse. | ||
| Billeddannelse: opsamling og analyse | Optagne billeder af lymfekredsløbet er ikke tilfredsstillende | Dissektion problem (lymfeknuder mangler) | Medtag omhyggeligt ryghvirvler / kraniet tilstødende væv i din dissekeret prøve, i henhold til lymfekredskreds, som du ønsker at billedet. |
| Problem med billedbehandling | 1. Ændre erhvervelse parametre LSFM: laser intensitet, lys-ark numerisk blænde, tykkelse af lys-ark, redegørelse tid. 2. Ans anbringe prøven i støtten for at reducere den sti, der er tilbagelagt af lys gennem vævet, indtil målet. 3. Sørg for, at der ikke er bobler inde i vævsprøven under erhvervelsen. |
Tabel 2: Fejlfindingsrådgivning for hvert trin i protokollen, herunder mulige problemer og løsninger.
Discussion
iDISCO+/LSFM-protokollen giver hidtil usete 3D-visninger af det CNS-tilknyttede lymfenetværk i det omgivende væv på celleopløsningsniveau. Denne protokol er godt tilpasset til mellemstore prøver, ikke exeeding 1,5 cm3,på grund af begrænsningerne i LSFM optiske system, den reducerede arbejdsafstand, og den store størrelse af kommercielle mål linser til høj opløsning mikroskopi23. Denne begrænsning forhindrer opfange hele hjerne-associerede lymfesystem. Det er vigtigt at bemærke, at undersøgelsesområdet skal afgrænses forsigtigt, og at vævene omkring CNS skal dissekeres omhyggeligt for at omfatte de ekstrakranielle lymfekar og MF'er, der bidrager til hele lymfekredsløbet (tabel 2).
Ud over størrelse og anatomiske overvejelser varierer kompleksiteten af omgivende mesenkymale væv langs kraniet og rygsøjlen, hvilket kræver tilpasning af afkalkning og forafklaringsbehandling for at opnå en homogen prøveafklaring og tillade lysstråleformering i et blødt isotropisk biologisk væv. I mangel af knogler, LFSM billeddannelse af hjernen eller rygmarvsvæv ikke nødvendiggør afkalkning trin, og den endelige opløsning af de optagne billeder er optimal19. Den ovenfor beskrevne protokol, som omfatter et mildt afkalkningstrin med Morses opløsning, er godt tilpasset til LSFM-billeddannelse af rygsøjlen som vist i figur 1 og figur 4. I modsætning hertil halsregionen viser en særlig kompleks knogle anatomi ud over flere lag af muskler, fedt og kirtelvæv, som reducerer kvaliteten af tilfangetagne LSFM billeder, som afspejles i figur 3B. LSFM-billeddannelse i hals- og livmoderhalsområdet kan således forbedres ved en strengere behandling af væv; f.eks. med EDTA, som tidligere rapporteret24. Afkalkningstrinnet er derfor kritisk, og afkalkningsbetingelserne skal tidligere testes for hvert anvendte antistof, før den fulde iDISCO+ protokol ( tabel 2 )påbegyndes.
Mens iDISCO+/LSFM-protokollen giver mulighed for at oprette en 3D-visning af forbindelseskredsløb mellem meningeal- og epiduralrum og tilhørende LN'er, den direkte kvantitative analyse af lymfekrululaturen fra LSFM-taget billeder er ikke mulig af følgende grunde: 1) afgrænsning af lymfekarkredsløb er upålidelig på grund af det diskontinuerlige mønster af lymfemarkørudtryk, fordi membranærvely 1 er hereterogentfordelt 21 og PROX1 har et nukleart udtryksmønster22 2) den heterogene indtrængen af antistoffer, samt anisotropi, der kan vare ved i det biologiske væv på grund af ufuldstændig og heterogen afkalkning og preclearing. LSFM-billeddannelse skal derfor udvides med virtual reality-værktøjer, der muliggør interaktiv visualisering og dermed letter kvantificeringen af lymfevaskulaturen (www.syglass.io). Det er også bemærkelsesværdigt, at den præcise beskrivelse af det CNS-tilknyttede kredsløb kræver sikkerhedskopiering af LSFM-oplysninger med konfokale højopløsningsdata, der er opnået ved konventionel immunmærkning på tynde (5-10 μm) kryostat eller paraffininddene vævssektioner, især for præcist at lokalisere lymfebeholdernes position med hensyn til dura mater og CSF, som tidligererapporteret 11,14,18.
IDISCO+/LSFM-protokollen giver mulighed for tredimensionel visualisering af makromolekylær dræning i det CNS-tilknyttede lymfesystem, som vist i figur 3 og figur 4. Den funktionelle vurdering af lymfedrænage kræver imidlertid ud over anbefalingerne til ovennævnte iDISCO+/LSFM-protokol efter en streng procedure, da det endelige resultat afhænger af kvaliteten af injektionskirurgien, valget af leveringsstedet, typen og den injicerede mængde af den anvendte makromolekylemarkør og tidspunktet for ofringen efter sporingsadministration (tabel 2). På grund af variationer i spormønsteret mellem indsprøjtede dyr kræver karakteriseringen af lymfedrænagekredsløb store forsøgsgrupper (>10 ved injektionstilstand). I den fremlagte protokol skal dura-materen punkteres før injektion for at forhindre uønskede læsioner og indtrængning i CNS-vævene. 2) det injicerede volumen skal være mindre end 2 μL for at begrænse uønsket diffusion gennem injektionshullet langs injektionskapillæren ind i epiduralrummet eller ekstravertebralt væv; 3) dybheden af injektion kapillær indsættelse skal begrænses til 2 mm under dura mater for at undgå CNS skade eller mistargeting i ICM og intraspinal injektioner, henholdsvis. Bemærk også, at en supplerende konfokal analyse af tilstødende vertebrale segmenter, som angivet ovenfor, skal udføres for at vurdere tilstedeværelsen af injiceret sporstof inde i lymfekar. Denne analyse kræver, at der fastlægges intensitetsprofilområder for sporstof og lymfemarkør på tværsnit af markørmærkede lymfekar. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at påvise OVA555 optagelse af ThLb lymfeknuder på 15 min efter injektion (supplerende figur 5F i Jacob et al.14). Det er dog ikke illustreret for anti-LYVE1-sporstof i denne undersøgelse (figur 4).
Blandt mulige CSF-sporstoffer er OVA-A555 en glimrende mulighed, da det er modstandsdygtigt over for iDISCO+ protokolbehandlinger og opretholder høj fluorescens for LSFM-billeddannelse. Bemærk dog, at type sporstoftypen skal vælges i overensstemmelse med analysetidspunktet (tabel 1 og tabel 2) . Som rapporteret ovenfor observeres OVA-A555 mærkning af lokale vertebrale lymfekar ved 15 min efter injektion14. OVA-A555 påvises dog ikke længere i disse lokale lymfekredsløb ved 45 min efter injektion (Figur 3) i modsætning til anti-LYVE1 antistoffet (Figur 4).
Afslutningsvis er iDISCO+/LSFM-protokollen godt tilpasset til undersøgelse af 3D-strukturen og dræningen af det CNS-associerede lymfesystem under fysiologiske og patologiske forhold såsom CNS- og vertebrale kolonnekræft eller vertebrale knogle- og ledsygdomme. Selv om den fulde procedure er lang og kræver metodologisk stringens, det giver værdifulde, unikke oplysninger, når de anvendes med supplerende analyse ved hjælp af virtual reality-værktøjer og høj opløsning konfokale billeddannelse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale, Agence Nationale Recherche (ANR-17-CE14-0005-03), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC 2017), Carnot Moduration (til L.J.), Universidade Federal de Rio de Janiero (UFRJ for J.B.), NIH (R01EB016629-01) og Yale School of Medicine. Vi anerkender ICM platforme: ICM-QUANT for cellulære billedbehandling og ICM-histomics for immunohistochemistry. Alt dyrearbejde blev udført på PHENO-ICMice-anlægget. Kernen understøttes af 2 "Investissements d'avenir" (ANR-10- IAIHU-06 og ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS) og "Fondation pour la Recherche Médicale". Vi anerkender Nicolas Renier for metodologisk rådgivning og manuskriptlæsning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge tubes: 0.2ml | Eppendorf | 30124359 | |
| Centrifuge tubes: 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Conical centrifuge tubes: 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tubes: 50ml | Falcon | 352070 | |
| Microtome blade 80mm | Microm Microtech France | F/MM35P | |
| Needles 26G (0.45x13 mm) | Terumo | AN*2613R1 | |
| Syringe 1ml | Terumo | SS+01H1 | |
| Microscopes and imaging softwares | |||
| AxioZoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope, equipped with an ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera (Hamamatsu Photonics) or an OptiMOS sCMOS camera | Zeiss | ||
| Imspector Microscope controller software, Version v144 (acquisiton software) | Abberior instruments | ||
| Imaris File Converter x64 9.2.0(file convertion software) , Imaris stitcher software 9.2.0 (stitcher software), Imaris x64 9.2.0 (3D software) | OXFORD instruments | ||
| LED lasers (OBIS) LVBT Laser module 2nd generayion | COHERENT | ||
| Ultramicroscope II equipped with a sCMOS camera (Andor Neo) and a 4 × /0.3 objective lens (LVMI-Fluor WD6) | LaVision Biotec | ||
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 568 Donkey anti Rabbit | Thermo Fisher | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti goat | Jackson ImmunoResearch | 705-605-147 | |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | |
| Anti-LYVE1 polyclonal antibody | Angiobio | #11-034 | |
| Anti-PROX1 goat polyclonal IgG antibody | R&D systems | #AF2727 | |
| Buprenorphine Injection Ampoules (Buprecare solution, 0.3mg/ml) | Animalcare | Ampule 1ml | |
| Dibenzyl Ether 100% (DBE) | Sigma Aldrich | 108014 | |
| Dichloromethane 100% (DCM) | Sigma Aldrich | 270997 | |
| Formic acid 99% | CARLO ERBA | 405793 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G.7126 | |
| Heparine sodium salt from porcine | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Hydrogen peroxide solution (H2O2 30%) | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Isoflurane (Iso-Vet 100%) | Piramal | NDC 66794-013-10 | |
| Methanol 100% | Sigma Aldrich | 322415 | |
| Ovalbumin Alexa Fluor 555 Conjugate | Invitrogen | 11549176 | |
| Phosphate Buffer Solution PBS (stock solution 10X) | Euromedex | ET330-A | |
| Sodium Pentobarbital (Euthasol 400mg/mL) | Dechra | 08718469445110 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 6132-04-3 | |
| Surgical tools and equipments | |||
| Anaesthesia system | Univentor | Univentor 410 Anaesthesia Unit | |
| Glass micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Heating pad | CMA Microdialysis AB | CMA 450 Temperature controller | |
| Microcapillaries (Glass Capillaries) | Harvard Apparatus | GC120-15 | |
| Microforceps, forceps,dissection scissors and Michel Suture Clips (7.5 × 1.75mm) | Fine Science Tool | 12040-01 | |
| Scalpel (sterile disposable scalpel 23) | Swann-Norton | 0510 | |
| Stereotaxic apparatus | KOPF | Model 940 | |
| Syringe Hamilton 10µl 701N | Hamilton | 28618-U | |
| Warm air System | Vet-Tech LTD | HE011 |
References
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., Goldman, S. A., Nedergaard, M.
- Engelhardt, B., et al. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system. Acta Neuropathologica. 132, 317-338 (2016).
- Benveniste, H., et al. The Glymphatic System and Waste Clearance with Brain Aging: A Review. Gerontology. , 1-14 (2018).
- Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Lymphatics in Neurological Disorders: A Neuro-Lympho-Vascular Component of Multiple Sclerosis and Alzheimer's Disease. Neuron. 91 (5), 957-973 (2016).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Ma, Q., Decker, Y., Müller, A., Ineichen, B. V., Proulx, S. T. Clearance of cerebrospinal fluid from the sacral spine through lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 216 (11), 2492-2502 (2019).
- Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3210-3219 (2017).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. The Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
- Antila, S., et al. Development and plasticity of meningeal lymphatic vessels. The Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3645-3667 (2017).
- Ahn, J. H., et al. Meningeal lymphatic vessels at the skull base drain cerebrospinal fluid. Nature. 572 (7767), 62-66 (2019).
- Pollay, M. The function and structure of the cerebrospinal fluid outflow system. Cerebrospinal Fluid Research. 7, 9 (2010).
- Jacob, L., et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nature Communications. 10 (1), 1-16 (2019).
- Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Song, E., et al. VEGF-C-driven lymphatic drainage enables immunosurveillance of brain tumours. Nature. 577 (7792), 689-694 (2020).
- Absinta, M., et al. Human and nonhuman primate meninges harbor lymphatic vessels that can be visualized noninvasively by MRI. eLife. 6, 29738 (2017).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Jackson, D. G., Prevo, R., Clasper, S., Banerji, S. LYVE-1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends in Immunology. 22 (6), 317-321 (2001).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
- Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P.
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
