Her præsenterer vi en detaljeret protokol til undersøgelse af neuronal α-synucleinakkumulering i primære muse dopaminneuroner. Fosforylerede α-synucleinaggregater i neuroner induceres med præformede α-synuclein fibrils. Automatiseret billeddannelse af immunfluorescent mærket celler og upartisk billedanalyse gør denne robuste protokol egnet til medium-til-høj gennemløb screening af lægemidler, der hæmmer α-synuclein akkumulering.
Målet med denne protokol er at etablere en robust og reproducerbar model af α-synuclein akkumulering i primære dopamin neuroner. Kombineret med immunsinmination og upartisk automatiseret billedanalyse, denne model giver mulighed for analyse af virkningerne af narkotika og genetiske manipulationer på α-synuclein aggregering i neuronal kulturer. Primær midbrain kulturer giver en pålidelig kilde til bona fide embryonale dopamin neuroner. I denne protokol efterlignes kendetegnende histopatologi af Parkinsons sygdom, Lewy bodies (LB), ved tilsætning af α-synuclein præ-formede fibriller (PFFs) direkte til neuronal kultur medier. Akkumulering af endogene fosforylerede α-synuclein i soma af dopamin neuroner påvises ved immunseende allerede 7 dage efter FSR tilsætning. In vitro cellekultur betingelser er også egnet til anvendelse og evaluering af behandlinger, der forhindrer α-synuclein akkumulering, såsom små molekyle lægemidler og neurotrofiske faktorer, samt lentivirus vektorer for genetisk manipulation (f.eks med CRISPR/Cas9). Skabning af neuroner i 96 brøndplader øger robustheden og kraften i de eksperimentelle opsætninger. Ved forsøgets afslutning er cellerne fastgjort med paraformaldehyd for immunocytokemi og fluorescensmikroskopi billeddannelse. Multispektrale fluorescensbilleder opnås via automatiseret mikroskopi af 96 brøndplader. Disse data er kvantificeret (f.eks, tælle antallet af fosfo-α-synuclein-holdige dopamin neuroner per brønd) med brugen af gratis software, der giver en platform for upartisk højt indhold fænotype analyse. PS-induceret modellering af fosforyleret α-synuclein akkumulering i primære dopamin neuroner giver et pålideligt værktøj til at studere de underliggende mekanismer mægle dannelse og eliminering af α-synuclein indeslutninger, med mulighed for høj-throughput drug screening og cellulære fænotype analyse.
Parkinsons sygdom (PD) er en neurodegenerativ lidelse karakteriseret ved død af midbrain dopamin neuroner i substantia nigra (SN), efterfølgende tab af dopamin tone i basal ganglier, og deraf følgende motoriske svækkelser1,2. En stor histopatologisk træk i hjernen hos PD patienter er intracellulære protein / lipid aggregater findes i neuronal soma, kaldet Lewy organer (LB), eller i neurites, Lewy neurites (LN), kollektivt kendt som Lewy patologi3. Lewy patologi i hjernen synes at udvikle sig med fremrykkende PD ligner spredningen af patogene faktorer gennem neuronale forbindelser. Rigelig Lewy patologi findes i dopamin neuroner i SN og celler i andre områder ramt af neurodegeneration4. Men under sygdomsprogression, spredning og debut af protein aggregering ikke altid korrelerer med neuronal død og det nøjagtige bidrag Lewy patologi til neuronal død er stadig uklart5.
LB og LN havde vist sig at bestå af membranøse og proteinholdige komponenter3. Førstnævnte er membranfragmenter, vesikulære strukturer (muligvis lysosomer og autophagosomes) og mitokondrier3. Sidstnævnte består af mindst 300 forskellige proteiner6. En hallmark undersøgelse af Spillantini et al.7 viste, at den vigtigste proteinkomponent i Lewy patologi er α-synuclein. Højt udtrykt i neuroner, og forbundet med membran fusion og neurotransmitter frigivelse, α-synuclein i Lewy patologi er til stede for det meste i fejlfoldet, amyloid fibril form, hvoraf størstedelen er fosforyleret på Ser129 (pS129-αsyn)4,8.
Vigtigere, det blev også vist, at på grund af sin prion-lignende egenskaber, misfolded α-synuclein kan have en årsagssammenhæng rolle i Lewy patologi dannelse4. De prionlignende egenskaber af forkertfoldet α-synuclein blev vist med både midbrainekstrakter fra patienter og eksogent fremstillet α-synuclein præforme fibriller (PFF’ er) til at fremkalde α-synucleinaggregater i neuroner i kultur og in vivo9,10. PFF’er udgør en pålidelig og robust model til undersøgelse af udviklingen af α-synucleinpatologi i dopaminneuroner. Når PFF’er anvendes på dyrkede primære neuroner eller injiceres i dyrets hjerne, fører de til dannelsen af α-synucleinholdige indeslutninger i neurites og celle soma11, der opsummerer mange funktioner, der ses i Lewy-patologien. Observerede indeslutninger er vaskemiddel-uopløselige i Triton X, ubiquitinated, plettet med amyloid specifikke farvestof Thioflavin S, og indeholder α-synuclein hyperphosphorylated ved Ser12911,12. Det er vigtigt, at disse indeslutninger ikke dannes i α-synuclein knockout dyr11,hvilket indikerer afhængigheden af deres dannelse af endogene α-synuclein.
Ikke desto mindre er det vanskeligt direkte at sammenligne FSE-inducerede indeslutninger og Lewy patologi findes i PD patienter, fordi menneskelige LBs og LNs er meget heterogene3. Observeret heterogenitet af Lewy patologi kan være forårsaget af forskellige stadier af dannelsen, forskellige anatomiske placering, eller forskelle i kropsbygning af forkert foldet α-synuclein indleder aggregeringsprocessen. De samme faktorer kan påvirke FSR-inducerede pS129-αsyn positive inklusioner. For nylig blev det faktisk påvist, at FS129-αsyn positive inklusioner i primære neuronale kulturer repræsenterer meget tidlige stadier af patologi, der kan modnes til strukturer, der ligner LB efter længere tids inkubationstid12,13.
Modellering tidlig spredning og akkumulering af forkert foldet α-synuclein med PFF’er er værdifuld for udviklingen af lægemidler, da Lewy patologispredning betragtes som en af de tidlige sygdomsmarkører. Derfor kan aggregerings-forebyggende behandlinger være lovende for at stoppe eller bremse udviklingen af PD på meget tidlige stadier. Flere kliniske forsøg, der har til formål at bremse eller stoppe akkumulering af α-synuclein, eri gang 14. For senere patienter, transplantation af dopamin neuronale stamfædre kan være en bedre behandling alternativ15. Lewy patologi blev imidlertid dokumenteret i transplanterede embryonale neuroner under post mortem-analysen af PD-patienthjerner16,17, hvilket også indikerer behovet for beskyttelse mod akkumulering af α-synuclein.
In vitro, α-synuclein PFFs er kendt for at fremkalde aggregering i udødeliggjorte cellelinjer, eller mere almindeligt, i gnavere primære hippocampal eller kortikale neuroner. Ingen af disse er tæt på at opsummere dopamin neuroner10. Ætsning af disse neuroner kræver tæt belægning af visse antal neuroner in vitro18. For at opnå høj belægningsgrad med begrænset materiale (f.eks primære dopamin neuroner), mikroøen ætsning metode er almindeligt udnyttet. I mikro ø liggende, celler er i første omgang belagt i en lille dråbe medium (normalt et par mikroliter) holdes sammen af overfladespænding i midten af en stor brønd18. Efter neuronerne vedhæfte, hele brønden er fyldt med mediet, mens cellerne forbliver begrænset ved høj tæthed i den lille plating område. Ud over at opnå høj belægningsgrad forhindrer mikroøer også plating nær kanterne af brønde, hvor der er hyppigt variationer i celletæthed og overlevelse. Mikroøer bruges ofte i relativt store brønde eller retter; men, etablering midbrain neuronal kulturer i mikro øer i 96 godt plade format gør det muligt at studere Lewy patologi i bona fide dopamin neuroner med medium-til-high-throughput magt. In vitro eksperimenter med disse neuroner tillod os at opdage glial celle linje-afledt neurotrofisk faktor (GDNF), som fremmer overlevelsen af modne dopamin neuroner in vitro og in vivo19,20,21,22 og forhindrer også dannelsen af α-synuclein aggregater i dopamin neuroner23. Human patient-induceret pluripotente stamceller-afledte dopamin neuroner udgør en mere præcis model på grund af deres menneskelige oprindelse og længere overlevelse tid in vitro. Induktion af α-synucleinpatologi i humane neuroner observeres dog efter flere måneder sammenlignet med en uge hos embryonale neuroner med musen og/eller med flere stressorer (f.eks. kombination af α-synucleinoverekspression og PFF’ er)24,25. Desuden, vedligeholdelse af humane dopamin neuroner er dyrere og besværlige i forhold til primære embryonale neuroner, hovedsagelig begrænse deres anvendelse i høj-throughput applikationer.
Desuden kan primære dopaminneuronale kulturer være genetisk modificerede (f.eks. med CRISPR/Cas9) og/eller behandles med farmakologiske midler23. De udgør en hurtig og reproducerbar platform for applikationer som molekylær vej dissektion og narkotika bibliotek screening. Selv om der kan opnås begrænset materiale fra disse kulturer, er det stadig muligt at foretage analyser af mindre genomforskning/proteomiske. Ætsning primære neuroner i 96 godt format er bedre for immunocytokemi og fluorescens mikroskopi teknikker, efterfulgt af højt indhold fænotype analyse. Multispektrale fluorescensbilleder, der stammer fra automatiseret billeddannelse af 96 brøndplader, kan konverteres til kvantitative resultater (f.eks. antallet af LB-holdige neuroner pr. brønd). Sådanne analyser kan gøres med fri software, såsom CellProfiler26,27. Samlet set giver primære embryonale midbrainkulturer belagt med 96 brøndplader en robust og effektiv platform til at studere dopaminneuroner og α-synuclein-sammenlægning med mulighed for screening af fænotype med høj gennemløb.
Spredning Lewy patologi, hvoraf pS129-αsyn er en vigtig bestanddel, er en histopatologisk kendetegn for PD. Standsning eller bremse ophobning af aggregerede pS129-αsyn kan bremse degeneration af dopamin neuroner og progression af alfa-synucleinopati. Men, en mekanistisk forståelse af, hvordan pS129-αsyn sammenlægning bidrager til lukningen af dopamin neuroner stadig skal etableres. Dokumentation fra humane postmortemundersøgelser af hjerneprøver fra patienter på forskellige stadier af sygdommen samt observation af pS129-αsyn positiv inklusion i transplanterede foneturoner tyder stærkt på, at Lewy-patologien spredesmellem cellerne 16,17,33. Derfor blev prionlignende spredning af pS129-αsyn for nylig opsummeret ved hjælp af α-synucleinPFFs 9,10. Etablering af en robust, omkostningseffektiv, og relativt høj- eller medium-throughput model af pS129-αsyn spredning og akkumulering, specielt i dopamin neuroner, kan betydeligt fremskynde søgningen efter nye behandlinger og forbindelser ændre denne proces.
Fordi tab af dopamin neuroner er den vigtigste årsag til motoriske symptomer i PD og disse celler har mange unikke egenskaber2,,34,,35, modellering af prion-lignende spredning af pS129-αsyn i dopamin neuroner er den mest relevante type model fra translationel perspektiv. Protokoller, der anvender mikroøkulturer af embryonale midbrainneuronner på 4 brøndplader og halvautomatisk kvantificering, er tidligerebeskrevet 18. Den protokol, der er beskrevet her, er tilpasset 96 brøndplader og giver mindre møjsommelig forberedelse af mikroøer, hvilket giver mulighed for forberedelse af op til fire plader, der indeholder 60 brønde hver af en erfaren forsker i løbet af en arbejdsdag. Ætsning dopamin neuroner i 96 godt plader giver mulighed for at teste lægemidler ved lavere mængder og muliggør høj transduktion satser med lentivirus vektorer. Det er også muligt at kombinere forskellige behandlinger for at udføre mere komplekse eksperimenter.
Før der anvendes behandlinger (herunder PFF’er), skal kvaliteten af ætsning kontrolleres med lysfeltmikroskopi. Hvis mikroskopisystemet ikke udnytter et CO2-kammer med opvarmning, bør cellerne ikke holdes uden for inkubatoren i mere end et par minutter, fordi primære muse dopaminneuroner er sarte og let stressede. Af samme grund tilrådes det, at den første billeddannelse skal ske efter 24 timers inkubation (mellem DIV1-DIV3). Cellerne skal synes at være levende med nuværende cellekroppe og homogent spredes inde i mikroøen. Primære neuroner ville have afgjort på PO-belagt jorden og begyndte at etablere neuronale fremskrivninger. Det er muligt at observere en lille klump celler (dvs. en diameter, der er mindre end 150-200 μm), som kan dannes, hvis triturationsprocessen ikke udføres korrekt, eller belægningsgraden er højere end anbefalet. Disse små klumper ville ikke påvirke forsøget, medmindre de er mere end et par per brønd og / eller større. Klumpede celler gør det meget vanskeligt at identificere immunhistokemiske markører og individuelle celler under billedanalysen. Det er vigtigt at undgå sådanne klumper ved omhyggelig belægning, triturating, og kontrollerende plating tæthed. Hvis disse betingelser ikke kan overholdes ensartet ved visse brønde, må disse defekte brønde ikke medtages i forsøget. En sådan udelukkelse bør ske, før behandlingen foretages.
Desuden udnyttelse af 96 godt plader giver mulighed for praktisk multichannel pipette brug under farvning procedurer og direkte visualisering med automatiskplade mikroskoper, yderligere at øge gennemløb. Udnyttelse af automatiseret billedkvantificering er nødvendig for analysen af data fra billedbehandlingsplatforme med højt indhold. Ud over evnen til at behandle tusindvis af billeder fra hvert eksperiment, sikrer det upartisk, identisk kvantificering af alle behandlingsgrupper. Den foreslåede arbejdsgang for billedanalysen er baseret på enkle principper for segmentering af dopaminneuroner, filtrering af korrekt segmenterede celler ved overvåget maskinlæring og efterfølgende kvantificering af fænotyper (pS129-αsyn positive og pS129-αsyn negative), igen ved overvåget maskinlæring. Selv om flere forskellige tilgange til denne opgave kan forestille sig, har vi fundet kombinationen af segmentering med machine learning at være den mest robuste for dopamin kulturer på grund af høj belægningsgrad, de forskellige former af dopamin neuroner, og tilstedeværelsen af stærkt farvede neurites. Den foreslåede billedanalyse algoritme blev gennemført i CellProfiler og CellProfiler Analyst, open source, frit tilgængelige højt indhold billedanalyse software26,27. Algoritmen kan også implementeres med andre billedanalyse software, enten open source (f.eks ImageJ / FIJI, KNIME) eller proprietære. Men det er vores erfaring, at disse ofte ofrer tilpasningsmuligheder for brugervenlighed og derfor måske ikke klarer sig godt i komplicerede analyser. Vi har konstateret, at CellProfiler og CellProfiler Analyst softwarepakker giver særligt pålidelige resultater ved at kombinere et betydeligt antal implementerede algoritmer, ekstrem fleksibilitet i udformningen af arbejdsgange, og samtidig håndtering og effektiv behandling af højindhold billedbehandling data.
Den beskrevne protokol kan også tilpasses til kvantificering af andre cellulære fænotyper karakteriseret ved immunsindeholding med forskellige antistoffer, såsom markører for andre neuronale populationer (f.eks. DAT, GAD67, 5-HT osv.) og proteinaggregater (f.eks. phospo-Tau, ubiquitin). Flere fluorescerende markører kan også kombineres for at skelne mellem flere fænotyper (f.eks. celler med indeslutninger på forskellige stadier af modning). Automatiseret klassificering af flere fænotyper bør også være let at implementere i de beskrevne billedanalysepipelines ved blot at tilføje en kanal, der indeholder immunfluorescerende billeder af yderligere markører, til måletrin og sortering af celler i flere spande. Udnyttelse af flere markører på samme tid ville imidlertid kræve optimering af immunstøbe og billeddannelse betingelser. Derudover anbefales det at anvende særlige sortvæggede 96 brøndplader, der udtrykkeligt er designet til fluorescerende mikroskop, for at opnå bedre kvalitet i immunofluorescensbilleddannelse. Disse kan dog være betydeligt dyrere end standardcellekulturplader, som er tilstrækkelige til den analyse, der er beskrevet i vores protokol.
Typen og kvaliteten af udnyttede PFF’er er afgørende for resultatet af forsøgene. PFF’er kan både påvirke analysens robusthed og fortolkningen af resultaterne. Præparatet betingelser kan påvirke såningseffektiviteten af PFF’er, og fs.36 Ikke desto mindre ligger forberedelsen og valideringen af PFF’er uden for denne artikels anvendelsesområde og er beskrevet i flerepublikationer 11,28,29,30. Ud over præparatprotokollen bør oprindelsesarten af α-synuclein i PFF’er (f.eks. mus, mennesker) og brugen af vildtype eller muteret protein (f.eks. humant A53T α-synuclein) tages i betragtning afhængigt af de særlige forsøgsbetingelser. Induktion af pS129-αsyn akkumulering ved PFF’er viste sig at være afhængig af kulturens alder (dvs. dage in vitro), hvor mere modne kulturer viste mere udtalt induktion11. Dette skyldes sandsynligvis det øgede antal neuronale forbindelser i mere modne kulturer, og øget α-synuclein protein niveauer. I vores hænder gav behandling med PFF’er på DIV8 de mest robuste resultater med udtalt akkumulering af pS129-αsyn i dopaminneneurn soma, uden at gå på kompromis med neuronal overlevelse. Den beskrevne protokol er velegnet til studiebehandlinger, der ændrer tidlige hændelser, der fører til aggregering af endogent α-synuclein, fordi vi kvantificerer pS129-αsyn positive inklusioner på et relativt tidligt tidspunkt, 7 dage efter inokulering med PFF’er. På dette tidspunkt, intrasomal indeslutninger er til stede i en betydelig brøkdel af celler og kan let skelnes ved immunsintaining mens ingen FSR-induceret celledød er observeret, forenkle fortolkningen af resultaterne. Det er vigtigt, at den beskrevne protokol i princippet kan ændres, da morfologien og sammensætningen af FSR-inducerede indeslutninger kan ændre sig over tid12,13, for at undersøge mere modne inklusioner ved fiksering og immunsåring på et senere tidspunkt. Men, holde dopamin neuroner i kulturen i længere end 15 dage kræver ekstrem pleje, og kan fremkalde yderligere variation på grund af celler ikke at overleve uafhængigt af PSPPokulering. Derudover, mere udvidede kulturer komplicere narkotika behandling tidsplaner. Mange forbindelser har begrænset eller ikke dårligt karakteriseret stabilitet i cellekulturmediet, og genopfyldning af et lægemiddel er ikke trivielt, fordi fuldstændig udveksling af medium kompromitterer dopaminkulturerne overlevelse.
Fosforylering af α-synuclein ved Ser129 rapporteres konsekvent i PSB-baserede modeller af α-synuclein-aggregering og colocalizes med markører for fejlfolde og aggregering såsom Thioflavin S, ubiquitin eller konformationsspecifikke antistoffer11,12. I vores hænder giver immunsisten for pS129-αsyn også det stærkeste signal med den laveste baggrund og er mest ligetil at analysere, hvilket giver robuste resultater, når flere behandlinger screenes. Det er vigtigt, at immunstøbe med pS129-αsyn antistof ikke registrerer PFF’er, der forbliver uden for cellerne, hvilket reducerer baggrunden betydeligt. Det er dog vigtigt at huske, at Ser129 fosforylering sandsynligvis er en af de tidligste processer i forbindelse med misfolding af α-synuclein og kan reguleres forskelligt under særlige forhold. Derfor bør alle resultater, der viser positive virkninger på pS129-αsyn, bekræftes af andre markører.
Den statistiske analyse bør tilpasses forsøgsdesignet på en sådan måde. Det er vigtigt at udføre forsøg i mindst tre uafhængige biologiske replikater (dvs. separate primære neuronale kulturer). Disse replikater skal forgyldes på forskellige plader og behandles uafhængigt. Vi analyserer data fra replikater på forskellige plader med random block design ANOVA37 for at tage højde for parringen af data til forskellige eksperimentelle plader.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker prof. Kelvin Luk for hans generøse gave af α-synuclein PFFs, Conjung Zheng for oprettelse og ætsning neuronal celler, og Light Mikroskopi Enhed ved Institut for Bioteknologi, University of Helsinki, for billeddannelse immunostained celler. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra 3i-Regeneration fra Business Finland (det finske finansieringsagentur for innovation), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Sigrid Juselius Foundation, og de lovpligtige midler fra Maj Institute of Pharmacology, PAS, Polen.
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |