여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.
이 프로토콜의 목표는 1 차도 파민 뉴런에서 α-synuclein 축적의 견고하고 재현 가능한 모델을 확립하는 것입니다. 면역 염색 및 편견없는 자동화 된 이미지 분석과 결합된 이 모델은 뉴런 배양에서 α-synuclein aggregation에 대한 약물 및 유전 적 조작의 영향을 분석 할 수 있습니다. 1 차적인 중뇌 배양은 선의의 배아 도파민 뉴런의 신뢰할 수있는 소스를 제공합니다. 본 프로토콜에서, 파킨슨병의 특징적 조직병리학, 루이 바디(LB)는, 신경 배양 매체에 직접 α-synuclein 사전 형성된 섬유브릴(PfFs)의 첨가에 의해 모방된다. 도파민 뉴런의 소마에 내인성 인산화 α-synuclein의 축적은 PFF 추가 후 7 일에서 이미 면역 염색에 의해 검출된다. 체외 세포 배양 조건은 또한 작은 분자 약물 및 신경 영양인과 같은 α-synuclein 축적을 방지하는 치료법의 적용 및 평가뿐만 아니라 유전자 조작을 위한 렌즈바이러스 벡터(예: CRISPR/Cas9 포함)에 적합합니다. 96 웰 플레이트에서 뉴런을 배양하여 실험 용 설정의 견고성과 힘을 증가시킵니다. 실험의 끝에서, 세포는 면역 세포 화학 및 형광 현미경 영상에 대한 파라 포름알데히드로 고정된다. 다중 스펙트럼 형광 심은 96 웰 플레이트의 자동화 된 현미경 검사를 통해 얻어진다. 이러한 데이터는 편견없는 고함량 표현형 분석을 위한 플랫폼을 제공하는 무료 소프트웨어를 사용하여 (예를 들어, 인계 α-synuclein 함유 도파민 뉴런의 수를 잘 계산)을 정량화한다. 1차 도파민 뉴런에서 인포이성 α-synuclein 축적의 PFF 유도 모델링은 고처리량 약물 스크리닝 및 세포 표현형 분석을 위한 기회와 함께 α-synuclein 포함의 형성 및 제거를 중재하는 기본 메커니즘을 연구하는 신뢰할 수 있는 도구를 제공한다.
파킨슨병(PD)은 지하 니그라(SN)에서 중뇌 도파민 뉴런의 사망, 기저신경질에서 도파민 톤의 후속 손실, 그리고 그에 따른 운동 장애1,,2를특징으로 하는 신경퇴행성 질환이다. PD 환자의 두뇌에 있는 중요한 조직 병리학 특징은 Lewy 바디 (LB)에게 불린 신경 세포 내 단백질/지질 집계, 또는 신경질에서, Lewy neurites (LN), 통칭Lewy병리학으로알려져 있습니다 3. 두뇌에 있는 Lewy 병리학은 신경 연결을 통해 병원성 요인의 퍼짐을 닮은 전진 PD와 함께 진행하는 것처럼 보입니다. 풍부한 Lewy 병리학은 신경 변성 4에 의해 영향을 받는 그밖 지역에 있는 SN및 세포에 있는 도파민 뉴런에서 찾아낸다4. 그러나, 질병 진행 도중, 단백질 집계의 퍼짐 및 개시는 항상 신경 죽음과 상관관계가 있지 않으며 신경 죽음에 Lewy 병리학의 정확한 기여는 아직도불분명5.
LB 와 LN은 membranous 및 단백질 성분3로구성된 것으로 나타났다. 전자는 막 파편, 혈관 구조 (아마도 리소좀 및 자가식) 및 미토콘드리아3입니다. 후자는 적어도 300 가지 다른 단백질6로구성됩니다. Spillantini외. 7에 의한 특징적인 연구 결과는 Lewy 병리학의 주요 단백질 성분이 α-synuclein이다는 것을 보여주었습니다. 뉴런에서 발현되고, 막 융합 및 신경전달물질 방출과 연계되고, 루이 병리학에서 α-synuclein은 대부분 잘못 접혀, 아밀로이드 피브릴 형태로 존재하며, 그 중 대부분은 Ser129(pS129-αsyn)4,,8에서인광된다.
중요한 것은, 또한 프리온과 같은 특성으로 인해 잘못 접힌 α-synuclein이 루이 병리학 형성4에서원인 역할을 할 수 있음을 입증하였다. 잘못 접힌 α-synuclein의 프리온 유사 특성은 환자로부터 중뇌 추출물과 외인성으로 제조된 α-synuclein 전형성 피브릴(PFF)으로 모두 배양 및 생체 내99,10의뉴런뉴클레인 골재를 유도하였다. PFF는 도파민 뉴런에서 α-synuclein 병리학의 진행을 연구하는 신뢰할 수 있고 강력한 모델을 제시합니다. PFF는 배양 된 1 차적인 뉴런에 적용되거나 동물 뇌에 주입될 때, 그들은 루이 병리학에서 볼 수있는 많은 특징을 재구성하는 신경질과 세포 소마(11)에 α-synuclein 함유 포함 포함의 형성으로 이어집니다. 관찰된 포함은 트리톤 X에서 세제-용용성, 유비퀴티네이트, 아밀로이드 특이염 티오플라빈 S로 염색되고, Ser12911,,12에서α-synuclein hyperphosphorylated를 함유한다. 중요한 것은, 이들 포함은 α-시뉴클레인 녹아웃동물(11)에서형성되지 않으며, 내인성 α-synuclein에 대한 형성의 의존성을 나타낸다.
그럼에도 불구하고, 인간 LB와 LN이 매우 이질적인3이기때문에 PD 환자에서 발견되는 PFF 유도 된 포함 및 Lewy 병리학을 직접 비교하기가 어렵습니다. Lewy 병리학의 관찰된 이질성은 형성의 다른 단계, 상이한 해부학적 위치, 또는 잘못된 접힌 α-synuclein의 형성의 차이에 의해 집합 프로세스를 개시하기 때문에 발생할 수 있습니다. 동일한 요인이 PFF 유도 pS129-αsyn 양성 포함에 영향을 미칠 수 있습니다. 실제로, 최근에는 1차 신경배양에서 PFF 유도 pS129-αsyn 양성 포함이 장기간 잠복기12,13후에LB를 밀접하게 닮은 구조로 성숙할 수 있는 병리학의 초기 단계를나타낸다는것이 입증되었다.
Lewy 병리학 확산이 초기 단계 질병 마커 중 하나로 간주되기 때문에 PFF를 가진 잘못 접힌 α-synuclein의 조기 확산 및 축적을 모델링하는 것은 약물 개발에 유용합니다. 따라서, 집계 예방 치료는 매우 초기 단계에서 PD의 진행을 중단하거나 늦추기 위해 유망할 수 있다. α-시뉴클레인 축적을 늦추거나 중지하기 위한 여러 임상 시험이 진행 중14회진행 중이다. 후기 환자의 경우, 도파민 뉴런 전구의 이식은 더 나은 치료 대안이 될 수 있다15. 그러나, Lewy 병리학은 PD 참을성 있는 두뇌의 사후 분석 도중 이식된 배아 뉴런에서 문서화되었다16,,17,또한 α-synuclein 축적에 대하여 보호를 위한 필요를 나타내는.
시험관에서, α-synuclein PFFs는 설치류 1차 해마 또는 피질 뉴런에서 불멸의 세포주에서 응집을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 어느 것도 도파민 뉴런을 다시 수상에 가깝지 않습니다10. 이러한 뉴런을 배양하려면 시험관 내 특정 수의 뉴런도금이 필요하다18. 제한된 물질(예: 1차 도파민 뉴런)으로 높은 도금 밀도를 달성하기 위해 마이크로 섬 배양 방법이 일반적으로 활용된다. 마이크로 섬 배양에서, 세포는 처음에 큰 우물18의중간에 표면 장력에 의해 함께 유지 된 매체 (일반적으로 몇 마이크로 리터)의 작은 방울에서 도금된다. 뉴런이 부착된 후, 세포가 작은 도금 영역에서 고밀도로 갇혀 있는 동안 전체 우물은 배지로 채워져 있습니다. 마이크로 섬은 높은 도금 밀도를 달성하는 것 외에도 세포 밀도와 생존의 변화가 빈번한 우물 가장자리 근처의 도금도 방지합니다. 마이크로 섬은 종종 상대적으로 큰 우물이나 요리에 활용; 그러나, 마이크로 섬에 중간 뇌 신경 배양을 설립 96 잘 플레이트 형식은 중간 – 고처리량 전력을 가진 선의의 도파민 뉴런에서 루이 병리학의 연구를 가능하게. 이러한 뉴런을 가진 체외 실험은 우리가 시험관 내및 생체 내19,,20,,21,22에서 성숙한 도파민 뉴런의 생존을 촉진하고 도파민 뉴런23에서α-synuclein 골체의 형성을 방지하는 신경교 세포 주 유래 신경 영양자 (GDNF)를 발견할 수 있었습니다., 인간 환자 유도 만능 줄기 세포 유래 도파민 뉴런은 인체 기원과 시험관내 의 생존 시간 이상으로 인해 더 정확한 모델을 구성합니다. 그러나, 인간 뉴런에서 α-synuclein 병리학의 유도는 마우스 배아 뉴런에서 1주일, 및/또는 다중 스트레스요인(예를 들어, α-synuclein 과발현 및 PFFs의 조합)에 비해 여러 달 후에 관찰된다24,,25. 또한, 인간의 도파민 뉴런의 유지 보수는 1 차적인 배아 뉴런에 비해 더 비싸고 힘들며, 본질적으로 고처리량 응용 프로그램에서 사용을 제한합니다.
또한, 1차 도파민 뉴런 배양은 유전자 변형(예를 들어, CRISPR/Cas9) 및/또는약리학제제(23)로치료될 수 있다. 그(것)들은 분자 통로 해부 및 약 도서관 검열 같이 응용을 위한 빠르고 재현가능한 플랫폼을 구성합니다. 이러한 배양에서 제한된 물질을 얻을 수 있지만, 여전히 작은 크기의 유전체학 / 프로테오믹스 분석을 수행 할 수 있습니다. 96 개의 잘 포맷에서 1 차적인 뉴런을 배양하는 것은 면역 세포 화학 및 형광 현미경 기술, 고함량 표현형 분석에 선행됩니다. 96개의 웰 플레이트의 자동화된 이미징에서 유래된 다중 스펙트럼 형광 이미지는 정량적 결과(예를 들어, 웰당 LB 함유 뉴런의 수)로 변환될 수 있다. 이러한 분석은 CellProfiler26,,27과같은 무료 소프트웨어로 수행 할 수 있습니다. 전반적으로, 96 개의 웰 플레이트에서 도금 된 1 차 배아 중뇌 배양은 높은 처리량 표현형 스크리닝의 기회와 함께 도파민 뉴런과 α-synuclein 응집을 연구하는 강력하고 효율적인 플랫폼을 제공합니다.
pS129-αsyn이 주요 성분인 Lewy 병리학을 확산시키는 것은 PD의 조직병리학적 특징입니다. 그러나, pS129-αsyn 집계도 도파민 뉴런의 죽음에 기여하는 방법의 기계적인 이해는 아직도 확립되어야 합니다. 이식된 태아 뉴런에서 pS129-αsyn 양성 포함의 관찰뿐만 아니라 질병의 다른 단계에서 환자로부터 뇌 샘플에 대한 인간 사후 연구에서 증거는 세포16,,17,33사이의 Lewy 병리학의확산을강력하게 시사한다. 따라서, pS129-αsyn의 프리온형 확산은 최근 α-시뉴클레인 PFFs9,,10을사용하여 회수되었다. 특히 도파민 뉴런에서 pS129-αsyn 확산 및 축적의 견고하고 비용 효율적이며 상대적으로 높은 또는 중간 처리량 모델을 확립하면 이 과정을 수정하는 새로운 치료법 및 화합물에 대한 검색 속도가 상당히 빨라질 수 있습니다.
도파민 뉴런의 손실은 PD에서 운동 증상의 주요 원인이기 때문에 이러한 세포는 많은 고유 한특성을가지고2,34,,35,도파민 뉴런에서 pS129-αsyn의 프리온 같은 확산의 모델링은 번역 관점에서 모델의 가장 관련성이 유형이다. 배아 중뇌 뉴런의 마이크로 섬 배양을 활용하는 프로토콜은 4개의 웰 플레이트및 반자동 정량화에 대해 이전에18개에설명되었다. 여기에 설명 된 프로토콜은 96 개의 우물 판에 적응하고 마이크로 섬의 덜 힘든 준비를 제공하므로 숙련 된 연구원이 한 근무 일 동안 각각 60 개의 우물을 포함하는 최대 4 개의 플레이트를 준비할 수 있습니다. 96 웰 플레이트에서 도파민 뉴런을 배양하면 더 적은 양으로 약물을 테스트할 수 있으며 렌티바이러스 벡터로 높은 트랜스듀션 속도를 가능하게 합니다. 또한 더 복잡한 실험을 수행하기 위해 다른 치료법을 결합할 수도 있습니다.
어떤 처리를 적용하기 전에 (PFF를 포함하여), 배양의 질은 밝은 필드 현미경 검사법으로 확인되어야 합니다. 현미경 시스템이 가열된 CO2 챔버를 활용하지 않는 경우, 1차 마우스 도파민 뉴런이 섬세하고 쉽게 스트레스를 받고 있기 때문에 세포는 몇 분 이상 인큐베이터 외부에 보관해서는 안 된다. 같은 이유로, 첫 번째 이미징은 24 h의 잠복식 후에 수행되어야한다는 것이 좋습니다 (DIV1-DIV3 사이). 세포는 현재 세포 체와 동질적으로 마이크로 섬 내부에 확산 살아 있는 것으로 나타납니다. 1 차적인 뉴런은 PO 코팅 된 땅에 정착하고 신경 투영을 확립하기 시작했을 것입니다. 트리튜션 공정이 제대로 이루어지지 않거나 도금 밀도가 권장보다 높으면 형성될 수 있는 작은 덩어리(즉, 150-200 μm 보다 작은 직경)를 관찰할 수 있다. 이 작은 덩어리는 잘 및 / 또는 더 크지 않는 한 실험에 영향을 미치지 않을 것입니다. 응집 세포는 이미지 분석 중에 면역 히스토케미컬 마커 및 개별 세포를 식별하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. 신중한 코팅, 삼중화 및 도금 밀도 를 제어하여 이러한 덩어리를 피하는 것이 필수적입니다. 이러한 조건의 균일성이 특정 우물에서 관찰할 수 없는 경우, 실험에 이러한 결함이 있는 우물을 포함하지 않는다. 이러한 배제는 모든 치료법을 실행하기 전에 수행해야합니다.
또한 96개의 웰 플레이트를 사용하면 스테인링 절차 와 자동 플레이트 현미경으로 직접 시각화하는 동안 편리한 멀티채널 파이펫 사용을 가능하게 하며, 처리량을 더욱 증가시합니다. 고콘텐츠 이미징 플랫폼의 데이터를 분석하는 데 는 자동화된 이미지 정량화의 활용이 필수적입니다. 각 실험에서 얻은 수천 개의 이미지를 처리하는 기능 외에도 모든 치료 그룹의 편견없고 동일한 정량화를 보장합니다. 이미지 분석을 위해 제안된 워크플로우는 도파민 뉴런을 분할하고, 감독된 기계 학습에 의해 올바르게 분할된 세포를 필터링하고, 표현형(pS129-αsyn 양성 및 pS129-αsyn 음성)의 정량화, 감독된 기계 학습에 의해 다시 정량화하는 간단한 원리를 기반으로 합니다. 비록이 작업에 대 한 몇 가지 다른 접근 을 구상 할 수 있습니다., 우리는 높은 도금 밀도도 도파민 문화에 대 한 가장 강력한 기계 학습세분화의 조합을 발견 했다, 도파민 뉴런의 다양 한 모양, 그리고 강하게 스테인드 neurites의 존재. 제안된 이미지 분석 알고리즘은 CellProfiler 및 CellProfiler 분석가, 오픈 소스, 자유롭게 사용할 수 있는 고함량 이미지 분석소프트웨어(26,27)에서27구현되었다. 이 알고리즘은 오픈 소스(예: ImageJ/FIJI, KNIME) 또는 독점 적인 다른 이미지 분석 소프트웨어로 구현될 수도 있습니다. 그러나 우리의 경험에서 이러한 종종 사용 편의를 위해 사용자 지정 기능을 희생, 따라서 복잡 한 분석에서 잘 수행 하지 않을 수 있습니다. CellProfiler 및 CellProfiler 분석가 소프트웨어 패키지는 구현된 알고리즘의 상당수, 워크플로우 설계에 대한 극도의 유연성, 고콘텐츠 이미징 데이터의 동시에 처리 및 효율적으로 처리함으로써 특히 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 나타났습니다.
상기 기재된 프로토콜은 또한 다른 신경 집단(예를 들어, DAT, GAD67, 5-HT 등)과 단백질 응집체(예를 들어, 인포타우, 유비퀴틴)의 마커와 같은 다른 항체를 가진 면역스테인링을 특징으로 하는 다른 세포 표현형의 정량화를 위해 적응될 수 있었다. 다중 형광 마커는 또한 다중 표현형을 구별하기 위하여 결합될 수 있었습니다 (예를 들면, 성숙의 다른 단계에서 포함되는 세포). 다중 표현형의 자동화된 분류는 또한 측정 단계에 추가 마커의 면역 형광 이미지를 포함하는 채널을 추가하고 세포를 여러 쓰레기통으로 분류함으로써 설명된 이미지 분석 파이프라인에서 구현하기 쉬워야 합니다. 동시에 여러 마커의 활용은 면역 염색 및 이미징 조건의 최적화를 필요로 한다. 또한 면역 형광 이미징의 더 나은 품질을 위해 형광 현미경을 위해 명시적으로 설계된 특수 검은 벽 96 웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 이들은 우리의 프로토콜에 기술된 분석을 위해 충분한 표준 세포 배양 판 보다는 상당히 더 비쌀 수 있습니다.
활용된 PFF의 유형과 품질은 실험 결과에 매우 중요합니다. PFF는 분석의 견고성과 결과의 해석에 영향을 줄 수 있습니다. 준비 조건은 PFFs의 파종 효율에 영향을 미칠 수 있으며, 실제로, 다른 생리적 특성을 가진 PFF “균주”가36보고되었습니다. 그럼에도 불구하고, PfF의 준비 및 검증은이 문서의 범위를 넘어 여러 간행물(11,,28,,29,,30)에설명되었습니다. 제제 프로토콜 이외에, PFFs(예를 들어, 마우스, 인간)에서 α-synuclein의 기원종 및 야생 형 또는 돌연변이 단백질의 사용(예를 들어, 인간 A53T α-synuclein)은 특정 실험 조건에 따라 고려되어야 한다. PFF에 의한 pS129-αsyn 축적의 유도는 배양연령(즉, 체외에서일)에 의존하는 것으로 나타났으며, 더 성숙한 배양은 더 뚜렷한유도(11)를나타냈다. 이것은 아마 더 성숙한 배양에 있는 신경 연결의 증가한 수 때문이고, 증가한 α-synuclein 단백질 수준. 우리의 손에, DIV8에서 PFFs와 치료는 가장 강력한 결과 준, 도파민 뉴런 소마에 pS129-αsyn의 뚜렷한 축적, 신경 생존을 손상 하지 않는 동안. 설명된 프로토콜은 PS129-αsyn 양성 포함을 비교적 초기 시점에서 정량화하기 때문에, PFF를 접종한 후 7일 후에 내인성 α-synuclein의 응집으로 이어지는 초기 이벤트를 수정하는 치료에 적합합니다. 이 시점에서, 내혈 포함은 세포의 상당한 분수에 존재하고 PFF 유도 세포 사멸이 관찰되지 않는 동안 면역 염색에 의해 쉽게 구별 될 수있다, 결과의 해석을 단순화. 중요한 것은, PFF 유도 포함의 형태 및 조성물이시간이지남에 따라 변경될 수 있기때문에,13,기재된 프로토콜은 원칙적으로, 나중에 고정 및 면역스테인팅에 의해 보다 성숙한 포함을 연구하도록 수정될 수 있다. 그러나, 보다 더 이상 문화에 도파민 뉴런을 유지 15 일 극단적인 치료를 필요로, PFF 접종에서 독립적으로 살아남지 못하는 세포 때문에 추가 변화를 유도할 수 있습니다. 추가적으로, 더 확장된 문화는 약 처리 일정을 복잡하게 합니다. 많은 화합물은 세포 배양 배지의 안정성을 제한하거나 제대로 특성화하지 않으며, 약물의 보충은 중간의 완전한 교환이 도파민 배양의 생존을 손상시키기 때문에 사소한 것이 아니다.
Ser129에서 α-synuclein의 인산화는 Α-synuclein 집계의 PFF 기반 모델에서 일관되게 보고되고 티오플라빈 S, 유비퀴틴 또는 형태 특이적 항체11,,12와같은 오접및 응집의 마커와 공존한다. 우리 손에는 pS129-αsyn용 면역 염색은 가장 낮은 배경을 가진 가장 강력한 신호를 제공하며 분석하기가 가장 간단하여 여러 치료법을 선별할 때 강력한 결과를 제공합니다. 중요한 것은, pS129-αsyn 항체를 가진 면역 염색은 세포 외부에 남아 있는 PFF를 검출하지 않으며, 배경을 현저하게 감소시킵니다. 그러나, Ser129 인산화는 아마 α-synuclein의 잘못 접기와 연결된 초기 프로세스 중 하나이며 특정 조건하에서 다르게 조절될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, pS129-αsyn에 긍정적인 영향을 보이는 모든 사실 인정은 다른 마커에 의해 확인되어야 한다.
통계 분석은 실험 설계에 따라 조정되어야 합니다. 적어도 3개의 독립적인 생물학 복제에서 실험을 수행하는 것이 필수적입니다 (즉, 별도의 1차 신경 배양). 이러한 복제는 다른 플레이트에 도금되고 독립적으로 처리되어야 합니다. 우리는 다른 실험 판에 대한 데이터의 페어링을 고려하기 위해 무작위 블록 디자인 ANOVA37과 다른 플레이트에 복제에서 얻은 데이터를 분석합니다.
The authors have nothing to disclose.
켈빈 루크 교수님, 신경세포를 확립하고 배양한 콘중 정 교수, 면역염색세포를 이미징하기 위한 헬싱키 생명공학연구소의 광현미경검사부에 감사드립니다. 이 작품은 비즈니스 핀란드 (핀란드 혁신기금 기관), 핀란드 #309489 아카데미, #293392, #319195 3i-재생의 보조금에 의해 지원되었다; 시그리드 주셀리우스 재단, 그리고 약리학의 Maj 연구소의 법정 기금, PAS, 폴란드.
0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |