Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein dynamisches Kultursystem zur Herstellung kontrollierter Größenaggregate menschlicher pluripotenter Stammzellen und zur weiteren Stimulierung der Differenzierung in Kleinhirnorganoiden unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen mit einem Einweg-Bioreaktor.
Abstract
Das Kleinhirn spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts und der motorischen Koordination, und ein funktioneller Defekt in verschiedenen Kleinhirnneuronen kann eine Hirnfallfunktionsstörung auslösen. Der größte Teil des aktuellen Wissens über krankheitsbedingte neuronale Phänotypen basiert auf postmortalen Geweben, was das Verständnis von Krankheitsprogression und Entwicklung erschwert. Tiermodelle und verewigte Zelllinien wurden auch als Modelle für neurodegenerative Erkrankungen verwendet. Sie rekapitulieren jedoch nicht vollständig menschliche Krankheiten. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben ein großes Potenzial für die Krankheitsmodellierung und bieten eine wertvolle Quelle für regenerative Ansätze. In den letzten Jahren verbesserte die Erzeugung von zerebralen Organoiden aus patientenabgeleiteten iPSCs die Aussichten für die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen. Es fehlen jedoch Protokolle, die eine große Anzahl von Organoiden und eine hohe Ausbeute an ausgereiften Neuronen in 3D-Kultursystemen produzieren. Das vorgestellte Protokoll ist ein neuer Ansatz für die reproduzierbare und skalierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Organoiden unter chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung skalierbarer Einweg-Bioreaktoren, bei denen Organoide die Kleinhirnidentität erlangen. Die erzeugten Organoide zeichnen sich durch die Expression spezifischer Marker sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene aus. Die Analyse spezifischer Gruppen von Proteinen ermöglicht den Nachweis verschiedener Kleinhirnzellpopulationen, deren Lokalisierung für die Bewertung der organoiden Struktur wichtig ist. Organoide Kryosektionen und weitere Immunostainierung von Organoidscheiben werden verwendet, um das Vorhandensein spezifischer Kleinhirnzellpopulationen und ihre räumliche Organisation zu bewerten.
Introduction
Die Entstehung menschlicher pluripotenter Stammzellen (PSCs) stellt ein ausgezeichnetes Werkzeug für die regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung dar, da diese Zellen in die meisten Zelllinien des menschlichenKörpers1,2unterschieden werden können. Seit ihrer Entdeckung wurde berichtet, dass die PSC-Differenzierung mit verschiedenen Ansätzen verschiedene Krankheiten modelliert, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen3,4,5,6.
Kürzlich gab es Berichte über 3D-Kulturen, die von PSCs abgeleitet wurden, die menschlichen zerebralen Strukturen ähneln; Diese werden Gehirnorganoide3,7,8genannt. Die Erzeugung dieser Strukturen aus gesunden und patientenspezifischen PSCs bietet eine wertvolle Gelegenheit, menschliche Entwicklung und neuroentwicklungsbezogene Störungen zu modellieren. Die Methoden zur Erzeugung dieser gut organisierten Zerebralparese sind jedoch für ihre Großproduktion nur schwer anzuwenden. Um Strukturen zu erzeugen, die groß genug sind, um die Gewebemorphogenese ohne Nekrose innerhalb der Organoide zu rekapitulieren, stützen sich Protokolle auf die anfängliche neuronale Verpflichtung unter statischen Bedingungen, gefolgt von der Verkapselung in Hydrogelen und der nachfolgenden Kultur in dynamischen Systemen3. Solche Ansätze können jedoch den potenziellen Scale-up der organoiden Produktion einschränken. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um die PSC-Differenzierung auf bestimmte Regionen des zentralen Nervensystems zu lenken, einschließlich kortikaler, striataler, Mittelhirn- und Rückenmarksneuronen9,10,11,12, ist die Erzeugung spezifischer Hirnregionen unter dynamischen Bedingungen immer noch eine Herausforderung. Insbesondere die Erzeugung von reifen Kleinhirnneuronen in 3D-Strukturen muss noch beschrieben werden. Muguruma et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Kulturbedingungen, die die frühe Kleinhirnentwicklung13 rekapitulieren, und berichteten kürzlich über ein Protokoll, das es menschlichen embryonalen Stammzellen ermöglicht, eine polarisierte Struktur zu erzeugen, die an das erste Trimester-Kleinhirn7erinnert. Die Reifung von Kleinhirnneuronen in den gemeldeten Studien erfordert jedoch die Dissoziation der Organoide, die Sortierung von Kleinhirnvorläufern und die Kokultur mit Feederzellen in einem monolayern Kultursystem7,14,15,16. Daher ist die reproduzierbare Erzeugung der gewünschten Kleinhirn-Organoide zur Krankheitsmodellierung unter definierten Bedingungen immer noch eine Herausforderung, die mit der Variabilität der Kultur- und Feederquelle verbunden ist.
Dieses Protokoll stellt optimale Kulturbedingungen für die 3D-Erweiterung und die effiziente Differenzierung menschlicher PSCs in Kleinhirnneuronen mithilfe von einwegvertikalen Radbioreaktoren dar (siehe Materialtabelle für Spezifikationen), im Folgenden Bioreaktoren genannt. Bioreaktoren sind mit einem großen vertikalen Laufrad ausgestattet, das in Kombination mit einem U-förmigen Boden eine homogenere Scherverteilung im Inneren des Gefäßes ermöglicht und eine schonende, gleichmäßige Mischung und Partikelaufhängung mit reduzierten Rührgeschwindigkeiten17ermöglicht. Mit diesem System können Form- und größengesteuerte Zellaggregate gewonnen werden, was für eine homogenere und effizientere Differenzierung wichtig ist. Darüber hinaus kann eine größere Anzahl von iPSC-abgeleiteten Organoiden auf weniger mühsame Weise erzeugt werden.
Das Hauptmerkmal der Organoide, die 3D-Multizellstrukturen sind, die normalerweise aus Stammzellen gebildet werden, ist die Selbstorganisation verschiedener Zelltypen, die spezifische Formen bilden, wie sie bei der menschlichen Morphogenese18,19,20zu sehen sind. Daher ist die organoide Morphologie ein wichtiges Kriterium, das während des Differenzierungsprozesses bewertet werden muss. Die Kryosektion von Organoiden und die weitere Immunfärbung von Organoidscheiben mit einem bestimmten Satz von Antikörpern ermöglichen die räumliche Visualisierung molekularer Marker zur Analyse der Zellproliferation, Differenzierung, Zellpopulationsidentität und Apoptose. Mit diesem Protokoll wird durch immunstainierende organoide Kryosektionen eine anfängliche effiziente neuronale Bindung am7. Tag der Differenzierung beobachtet. Während der Differenzierung werden mehrere Zellpopulationen mit Kleinhirnidentität beobachtet. Nach 35 Tagen in diesem dynamischen System organisiert sich das Kleinhirn-Neuroepithel entlang einer apicobasalen Achse, mit einer apikalen Schicht aus sich ausbreitenden Vorläufern und basal gelegenen postmitotischen Neuronen. Während des Reifungsprozesses sind ab den Tagen 35 bis 90 der Differenzierung verschiedene Arten von Kleinhirnneuronen zu sehen, einschließlich Purkinje-Zellen (Calbindin+), Granulatzellen (PAX6+/MAP2+), Golgi-Zellen (Neurogranin+), unipolare Pinselzellen (TBR2+) und tiefe Kleinhirn-Nuklei-Projektionsneuronen (TBR1+). Auch wird eine nicht signifikante Menge des Zelltodes in den erzeugten Kleinhirn-Organoiden nach 90 Tagen in der Kultur beobachtet.
In diesem System reifen menschliche iPSC-abgeleitete Organoide zu verschiedenen Kleinhirnneuronen und überleben bis zu 3 Monate ohne die Notwendigkeit einer Dissoziation und Feeder-Cokultur, die eine Quelle menschlicher Kleinhirnneuronen für die Krankheitsmodellierung bietet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Bedarf an großen Zellzahlen sowie definierten Kulturbedingungen zur Generierung spezifischer Zelltypen für Arzneimittelscreenings und regenerative Medizinanwendungen hat die Entwicklung skalierbarer Kultursysteme vorangetrieben. In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen die skalierbare Generation von neuronalen Vorläufern und funktionellen Neuronen32,33,34berichtet, was signifikante Fortschritte bei der Entwicklung neue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 durch Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 an T.P.S und PD/BD/128376/2017 an D.E.S.N.), von FEDER kofinanzierte Projekte (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) und FCT durch Gewährung PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 und CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Außerdem wurden Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Grant Agreement-Nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017 bereitgestellt.
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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