ह्यूमन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल और इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा लक्षण वर्णन से परिपक्व सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की स्केलेबल जनरेशन
Summary
यह प्रोटोकॉल मानव बहुल स्टेम कोशिकाओं के नियंत्रित आकार के समुच्चय का उत्पादन करने के लिए एक गतिशील संस्कृति प्रणाली का वर्णन करता है और एकल उपयोग बायोरिएक्टर का उपयोग करके रासायनिक रूप से परिभाषित और फीडर-मुक्त स्थितियों के तहत सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड में भेदभाव को और प्रोत्साहित करता है।
Abstract
सेरिबैलम संतुलन और मोटर समन्वय के रखरखाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और विभिन्न सेरिबेलर न्यूरॉन्स में एक कार्यात्मक दोष सेरिबेलर डिसफंक्शन को ट्रिगर कर सकता है। रोग से संबंधित न्यूरोनल फेनोटाइप के बारे में वर्तमान ज्ञान के अधिकांश पोस्टमॉर्टम ऊतकों पर आधारित है, जो रोग प्रगति और विकास की समझ मुश्किल बनाता है । न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए मॉडल के रूप में पशु मॉडल और अमर सेल लाइनों का भी उपयोग किया गया है। हालांकि, वे पूरी तरह से मानव रोग का पुनर्पूंजीकरण नहीं करते हैं। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) रोग मॉडलिंग के लिए महान क्षमता है और पुनर्योजी दृष्टिकोण के लिए एक मूल्यवान स्रोत प्रदान करते हैं । हाल के वर्षों में, रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी से सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी ने न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मॉडलिंग की संभावनाओं में सुधार किया। हालांकि, प्रोटोकॉल है कि ऑर्गेनॉइड की बड़ी संख्या का उत्पादन और 3 डी संस्कृति प्रणालियों में परिपक्व न्यूरॉन्स की एक उच्च उपज की कमी है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्केलेबल एकल उपयोग बायोरिएक्टरों का उपयोग करके रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की प्रजनन योग्य और स्केलेबल पीढ़ी के लिए एक नया दृष्टिकोण है, जिसमें ऑर्गेनॉइड सेरिबेलर पहचान प्राप्त करते हैं। उत्पन्न ऑर्गेनॉइड को एमआरएनए और प्रोटीन दोनों स्तर पर विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति की विशेषता है। प्रोटीन के विशिष्ट समूहों का विश्लेषण विभिन्न सेरिबेलर सेल आबादी का पता लगाने की अनुमति देता है, जिसका स्थानीयकरण ऑर्गेनॉइड संरचना के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है। ऑर्गेनॉइड क्रायोसेक्शनिंग और ऑर्गेनॉइड स्लाइस के आगे इम्यूनोसटेनिंग का उपयोग विशिष्ट सेरिबेलर सेल आबादी और उनके स्थानिक संगठन की उपस्थिति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है।
Introduction
मानव बहुल स्टेम सेल (पीएससी) का उद्भव पुनर्योजी दवा और रोग मॉडलिंग के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि इन कोशिकाओं को मानव शरीर के अधिकांश सेल वंश में अंतर किया जा सकता है1,,2। उनकी खोज के बाद से, विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके पीएससी भेदभाव को विभिन्न रोगों को मॉडल करने के लिए सूचित किया गया है, जिसमें न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार3,,4,,5,,6शामिल हैं।
हाल ही में, मानव मस्तिष्क संरचनाओं जैसी पीएससी से प्राप्त 3 डी संस्कृतियों की रिपोर्टें आई हैं; ये कहाजाताहै ब्रेन ऑर्गेनॉइड 3,7,8. स्वस्थ और रोगी-विशिष्ट पीएससी दोनों से इन संरचनाओं का उत्पादन मानव विकास और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों को मॉडल करने का एक मूल्यवान अवसर प्रदान करता है। हालांकि, इन अच्छी तरह से संगठित मस्तिष्क संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को उनके बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए लागू करना मुश्किल है। ऑर्गेनॉइड के अंदर परिगलित किए बिना ऊतक मॉर्फोजेनेसिस को फिर से शुरू करने के लिए काफी बड़ी संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए, प्रोटोकॉल स्थिर परिस्थितियों में प्रारंभिक तंत्रिका प्रतिबद्धता पर भरोसा करते हैं, इसके बाद हाइड्रोगेल में एनकैप्सुलेशन और गतिशील प्रणालियों में बाद की संस्कृति3। हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण ऑर्गेनॉइड उत्पादन के संभावित पैमाने को सीमित कर सकते हैं। हालांकि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विशिष्ट क्षेत्रों में पीएससी भेदभाव को निर्देशित करने के प्रयास किए गए हैं, जिनमें कॉर्टिकल, स्ट्राटाल, मिडब्रेन और रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स9,10,,,11,,12शामिल हैं, गतिशील परिस्थितियों में विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की पीढ़ी अभी भी एक चुनौती है। विशेष रूप से, 3 डी संरचनाओं में परिपक्व सेरिबेलर न्यूरॉन्स की पीढ़ी का वर्णन अभी बाकी है। मुगुरूमा एट अल ने संस्कृति की स्थितियों की पीढ़ी का बीड़ा उठाया है जो प्रारंभिक सेरिबेलर विकास13 को पुनः प्राप्त करता है और हाल ही में एक प्रोटोकॉल की सूचना देता है जो मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं को पहली तिमाही सेरिबैलम7की याद ताजा करने वाली ध्रुवीकृत संरचना उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हालांकि, रिपोर्ट किए गए अध्ययनों में सेरिबेलर न्यूरॉन्स की परिपक्वता के लिए ऑर्गेनॉइड के वियोजन, सेरिबेलर जनकों की छंटाई और मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली7,14, 15,,,16में फीडर कोशिकाओं के साथ सहसंस्कृति की आवश्यकता होती है।,15 इसलिए, परिभाषित परिस्थितियों में रोग मॉडलिंग के लिए वांछित सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड की प्रजनन योग्य पीढ़ी अभी भी संस्कृति और फीडर स्रोत परिवर्तनशीलता से जुड़ी एक चुनौती है।
यह प्रोटोकॉल एकल उपयोग ऊर्ध्वाधर व्हील बायोरिएक्टर (विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें), इसके बाद बायोरिएक्टर कहा जाता है, का उपयोग करते हुए सेरिबेलर न्यूरॉन्स में मानव पीएससी के 3 डी विस्तार और कुशल भेदभाव के लिए इष्टतम संस्कृति की स्थिति प्रस्तुत करता है। बायोरिएक्टर एक बड़े ऊर्ध्वाधर इम्पेलर से लैस हैं, जो यू-आकार के नीचे के संयोजन में, पोत के अंदर एक अधिक सजातीय कतरनी वितरण प्रदान करते हैं, जिससे कम आंदोलन की गति17के साथ कोमल, समान मिश्रण और कण निलंबन की अनुमति मिलती है। इस प्रणाली के साथ, आकार और आकार नियंत्रित सेल समुच्चय प्राप्त किया जा सकता है, जो अधिक सजातीय और कुशल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, कम श्रमसाध्य तरीके से बड़ी संख्या में आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए जा सकते हैं।
ऑर्गेनॉइड की मुख्य विशेषता, जो आमतौर पर स्टेम सेल से बनने वाली 3 डी बहुकोशिकीय संरचनाएं हैं, विभिन्न कोशिका प्रकारों का आत्म-संगठन है,जो मानव मॉर्फोजेनेसिस18, 19,20में देखे गए विशिष्ट आकार बनाता है।,19 इसलिए, ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान एक महत्वपूर्ण कसौटी है जिसे भेदभाव प्रक्रिया के दौरान मूल्यांकन किया जाना है। ऑर्गेनॉइड का क्रायोसेक्शनिंग और एंटीबॉडी के एक विशिष्ट सेट के साथ ऑर्गेनॉइड स्लाइस का आगे इम्यूनोसटेनिंग कोशिका प्रसार, भेदभाव, सेल जनसंख्या पहचान और एपोप्टोसिस का विश्लेषण करने के लिए आणविक मार्कर के स्थानिक दृश्य की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, ऑर्गेनॉइड क्रायोसेक्शन को इम्यूनोसटेन करके, भेदभाव के 7वें दिन तक एक प्रारंभिक कुशल तंत्रिका प्रतिबद्धता देखी जाती है। भेदभाव के दौरान, सेरिबेलर पहचान के साथ कई सेल आबादी देखी जाती है। इस गतिशील प्रणाली में 35 दिनों के बाद, सेरिबेलर न्यूरोएपिथेलियम एक एपिकोबासल धुरी के साथ आयोजित होता है, जिसमें जनक जनक और बेसली स्थित पोस्टमिटोटिक न्यूरॉन्स की एक एपिकल परत होती है। परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान, भेदभाव के 35-90 दिनों से, सेरिबेलर न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार देखा जा सकता है, जिसमें पुरकिंजे कोशिकाएं (कैल्बिन्डिन+),ग्रैन्यूल कोशिकाएं (पैक्स6+ /MAP2+),गोलगी कोशिकाएं (न्यूरोग्रेन +), एकध्रुक्षुक्षु ब्रश कोशिकाएं (टीबीआर2+),और गहरे सेरिबेलर नाभिक अनुमानों न्यूरॉन्स (टी 1बीआर+)शामिल हैं।+ इसके अलावा, संस्कृति में 90 दिनों के बाद उत्पन्न सेरिबेलर ऑर्गेनॉइड में सेल डेथ की एक गैर-विशिष्ट मात्रा देखी जाती है।
इस प्रणाली में, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड विभिन्न सेरिबेलर न्यूरॉन्स में परिपक्व होते हैं और वियोजन और फीडर कोसंस्कृति की आवश्यकता के बिना 3 महीने तक जीवित रहते हैं, जो रोग मॉडलिंग के लिए मानव सेरिबेलर न्यूरॉन्स का स्रोत प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
दवा स्क्रीनिंग और पुनर्योजी दवा अनुप्रयोगों के लिए विशिष्ट सेल प्रकार उत्पन्न करने के लिए बड़े सेल नंबरों के साथ-साथ परिभाषित संस्कृति स्थितियों की आवश्यकता स्केलेबल संस्कृति प्रणालियों के विकास क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को फंडाकाओ पैरा ए सिनेसिया ई ए टेक्नोलोजिया (एफसीटी), पुर्तगाल (यूआईडीबी/04565/2020 द्वारा प्रोग्रामा ओपेरानल रीजनल डी लिस्बोआ 2020, प्रोजेक्ट एन 007317, द्वारा समर्थित किया गया था। पीडी/बीडी/105773/2014 से टी.पी.एस.और पीडी/बीडी/128376/2017 को डी.ई.एन.), फेडर (POR Lisboa 2020- Programa Operacional क्षेत्रीय डी लिस्बोआ पुर्तगाल द्वारा सह-वित्त पोषित परियोजनाएं 2020) और एफसीटी अनुदान पीएसी के माध्यम से-सटीक लिस्बोआ-01-0145-फेडरर-016394 और सेरेबेलर ऑर्गेनॉइड की सेरेबेलर ऑर्गेनॉइड की सेरेबेलर जनरेशन एटैक्सिया रिसर्च ग्रांट लिस्बोआ-01-0145-फेडर-029298। ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 739572-द डिस्कवरी सेंटर फॉर रिजेनरेटिव एंड प्रिसिजन मेडिसिन H2020-व्यापक-01-2016-2017 के तहत यूरोपियन यूनियन के क्षितिज २०२० रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम से फंडिंग भी मिली थी ।
Materials
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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