Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

Summary

Denne protokollen beskriver et dynamisk kultursystem for å produsere kontrollerte størrelsesaggregater av menneskelige pluripotente stamceller og ytterligere stimulere differensiering i lillehjernen organoider under kjemisk definerte og materfrie forhold ved hjelp av en engangsbioreaktor.

Abstract

Lillehjernen spiller en kritisk rolle i vedlikehold av balanse og motorisk koordinering, og en funksjonell defekt i forskjellige lillehjernen nevroner kan utløse lillehjernen dysfunksjon. Mesteparten av dagens kunnskap om sykdomsrelaterte nevronale fenotyper er basert på postmortemvev, noe som gjør forståelsen av sykdomsprogresjon og utvikling vanskelig. Dyremodeller og udødelige cellelinjer har også blitt brukt som modeller for nevrodegenerative lidelser. Imidlertid gjenoppretter de ikke helt menneskelig sykdom. Humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har stort potensial for sykdomsmodellering og gir en verdifull kilde til regenerative tilnærminger. I de senere årene har genereringen av cerebrale organoider fra pasientavledede iPSCer forbedret utsiktene for neurodegenerativ sykdomsmodellering. Imidlertid mangler protokoller som produserer et stort antall organoider og et høyt utbytte av modne nevroner i 3D-kultursystemer. Protokollen som presenteres er en ny tilnærming for reproduserbar og skalerbar generasjon av menneskelige iPSC-avledede organoider under kjemisk definerte forhold ved hjelp av skalerbare engangsbioreaktorer, der organoider får lillehjernens identitet. De genererte organoidene er preget av uttrykk for spesifikke markører på både mRNA og proteinnivå. Analysen av spesifikke grupper av proteiner tillater påvisning av forskjellige lillehjernecellepopulasjoner, hvis lokalisering er viktig for evaluering av organoid struktur. Organoid kryoseksjon og ytterligere immunstaining av organoidskiver brukes til å evaluere tilstedeværelsen av spesifikke lillehjernencellepopulasjoner og deres romlige organisasjon.

Introduction

Fremveksten av menneskelige pluripotente stamceller (PSCer) representerer et utmerket verktøy for regenerativ medisin og sykdomsmodellering, fordi disse cellene kan differensieres i de fleste cellelinjer i menneskekroppen^1,2. Siden oppdagelsen har PSC differensiering ved hjelp av ulike tilnærminger blitt rapportert å modellere ulike sykdommer, inkludert nevrodegenerative^{lidelser 3,4,5,6}.

Nylig har det vært rapporter om 3D-kulturer avledet fra PSCer som ligner menneskelige hjernestrukturer; disse kalles hjerneorganoider^3,7,8. Genereringen av disse strukturene fra både sunne og pasientspesifikke PSCer gir en verdifull mulighet til å modellere menneskelig utvikling og nevroutviklingsforstyrrelser. Metodene som brukes til å generere disse velorganiserte hjernestrukturene, er imidlertid vanskelige å søke om deres store produksjon. For å produsere strukturer som er store nok til å rekafulere vevmorfogenese uten nekrose inne i organoidene, er protokoller avhengige av den første nevrale forpliktelsen i statiske forhold, etterfulgt av innkapsling i hydrogeler og påfølgende kultur i dynamiske systemer³. Slike tilnærminger kan imidlertid begrense den potensielle oppskalering av organoidproduksjon. Selv om det er gjort forsøk på å lede PSC differensiering til bestemte regioner i sentralnervesystemet, inkludert kortikale, striatal, midbrain, og ryggmargsnevroner^9,,10,,11,12, er genereringen av spesifikke hjerneregioner under dynamiske forhold fortsatt en utfordring. Spesielt har generasjonen modne cerebellar nevroner i 3D-strukturer ennå ikke blitt beskrevet. Muguruma et al. pionerer generasjonen av kulturforhold som rekafulerer tidlig cerebellar utvikling¹³ og nylig rapportert en protokoll som gjør det mulig for menneskelige embryonale stamceller å generere en polarisert struktur som minner om første trimester lillehjernen⁷. Modningen av cerebellar nevroner i de rapporterte studiene krever imidlertid dissosiasjon av organoider, sortering av cerebellar stamfarer og kokultur med materceller i et monolayer kultursystem^7,14,15,16. Derfor er den reproduserbare generasjonen av de ønskede lillehjernen organoider for sykdomsmodellering under definerte forhold fortsatt en utfordring forbundet med kultur og materkildevariabilitet.

Denne protokollen presenterer optimale kulturforhold for 3D-utvidelse og effektiv differensiering av menneskelige PSCer i cerebellar nevroner ved hjelp av engangs vertikale hjul bioreaktorer (se Table of Materials for spesifikasjoner), heretter kalt bioreaktorer. Bioreaktorer er utstyrt med et stort vertikalt løpehjul, som i kombinasjon med en U-formet bunn gir en mer homogen skjærfordeling inne i fartøyet, slik at mild, jevn blanding og partikkelsuspensjon med reduserte agitasjonshastigheter¹⁷. Med dette systemet kan form og størrelseskontrollerte celleaggregater oppnås, noe som er viktig for en mer homogen og effektiv differensiering. Videre kan et større antall iPSC-avledede organoider genereres på en mindre arbeidskrevende måte.

Hovedtrekket i organoidene, som er 3D flercellede strukturer som vanligvis dannes fra stamceller, er selvorganiserende av forskjellige celletyper som danner bestemte former som de som er sett i menneskelig morfogenese^18,19,20. Derfor er organoid morfologi et viktig kriterium som skal evalueres under differensieringsprosessen. Kryoseksjon av organoider og ytterligere immunstaining av organoidskiver med et bestemt sett med antistoffer tillater romlig visualisering av molekylære markører for å analysere cellespredning, differensiering, cellepopulasjonsidentitet og apoptose. Med denne protokollen, ved å immunstaining organoide kryoseksjoner, observeres en innledende effektiv neural forpliktelse av^{den 7.} Under differensiering observeres flere cellepopulasjoner med lillehjernens identitet. Etter 35 dager i dette dynamiske systemet organiserer cerebellar neuroepithelium langs en apicobasal akse, med et apisk lag av voksende forfedre og basalt plassert postmitotiske nevroner. Under modningsprosessen, fra dag 35-90 av differensiering, kan distinkte typer cerebellar nevroner ses, inkludert Purkinje celler (Calbindin⁺), granulceller (PAX6⁺/ MAP2⁺), Golgi celler (Neurogranin⁺), unipolar børsteceller (TBR2⁺), og dype lillehjernen kjerner projeksjon nevroner (TBR⁺). Også en ubetydelig mengde celledød observeres i de genererte lillehjernen organoider etter 90 dager i kultur.

I dette systemet modnes menneskelige iPSC-avledede organoider til forskjellige lillehjernennevroner og overlever i opptil 3 måneder uten behov for dissosiasjon og materkokultur, noe som gir en kilde til menneskelige lillehjernernevroner for sykdomsmodellering.

Protocol

1. Passaging og vedlikehold av menneskelige iPSCer i monolayer kultur Utarbeidelse av plater Tin kjellermembranmatrisen (se Materialtabell)ved 4 °C og klargjør 60 μL aliquots. Frys aliquots ved -20 °C. For å belegge brønnene på en 6 brønnplate, tin en aliquot av kjelleren membran matrise på is. Når tinet tilsett 60 μL til 6 ml DMEM-F12. Forsiktig resuspend ved pipettering opp og ned. Tilsett 1 ml fortynnet kjellermembranmatriseløsning til hver brønn av…

Representative Results

Protokollen ble initiert ved å fremme celleaggregasjon ved hjelp av 0,1 L bioreaktorer (figur 1A). Encelle inokulasjon av iPSCene ble utført, med 250 000 celler/ml seeded i 60 ml medium med en agitasjonshastighet på 27 o/min. Dette ble definert som dag 0. Etter 24 timer dannet cellene effektivt spheroidformede aggregater (dag 1, figur 1B), og morfologien ble godt vedlikeholdt til dag 5, med en gradvis økning i størrelse, noe som viste en høy grad av homoge…

Discussion

Behovet for store celletall samt definerte kulturforhold for å generere spesifikke celletyper for narkotikascreening og regenerative medisinapplikasjoner har drivt utviklingen av skalerbare kultursystemer. I de senere årene har flere grupper rapportert den skalerbare generasjonen av nevrale stamfar og funksjonelle nevroner^32,33,34, noe som gir betydelige fremskritt i utviklingen av nye modeller for nevrodegenerative lidelser. …

Materials

3MM paper	WHA3030861	Merck
Accutase	A6964 – 500mL	Sigma	cell detachment medium
Anti-BARHL1 Antibody	HPA004809	Atlas Antibodies
Anti-Calbindin D-28k Antibody	CB28	Millipore
Anti-MAP2 Antibody	M4403	Sigma
Anti-N-Cadherin Antibody	610921	BD Transduction
Anti-NESTIN Antibody	MAB1259-SP	R&D
Anti-OLIG2 Antibody	MABN50	Millipore
Anti-PAX6 Antibody	PRB-278P	Covance
Anti-SOX2 Antibody	MAB2018	R&D
Anti-TBR1 Antibody	AB2261	Millipore
Anti-TBR2 Antibody	ab183991	Abcam
Anti-TUJ1 Antibody	801213	Biolegend
Apo-transferrin	T1147	Sigma
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit	5793 – 500mL	Stem cell tecnhnologies
Chemically defined lipid concentrate	11905031	ThermoFisher
Coverslips 24x60mm	631-1575	VWR
Crystallization-purified BSA	5470	Sigma
DAPI	10236276001	Sigma
Dibutyryl cAMP	SC- 201567B -500mg	Frilabo
DMEM-F12	32500-035	ThermoFisher
Fetal bovine serum	A3840001	ThermoFisher
Gelatin from bovine skin	G9391	Sigma
Glass Copling Jar	E94	ThermoFisher
Glutamax I	10566-016	ThermoFisher
Glycine	MB014001	NZYtech
Ham’s F12	21765029	ThermoFisher
Human Episomal iPSC Line	A18945	ThermoFisher	iPSC6.2
IMDM	12440046	ThermoFisher
Insulin	91077C	Sigma
iPS DF6-9-9T.B		WiCell
Iso-pentane	PHR1661-2ML	Sigma
L-Ascorbic acid	A-92902	Sigma
Matrigel	354230	Corning	basement membrane matrix
Monothioglycerol	M6154	Sigma
Mowiol	475904	Millipore	mounting medium
mTeSR1	85850 -500ml	Stem cell technologies
N2 supplement	17502048	ThermoFisher
Neurobasal	12348017	ThermoFisher
Paraformaldehyde	158127	Sigma
PBS-0.1 Single-Use Vessel	SKU: IA-0.1-D-001	PBS Biotech
PBS-MINI MagDrive Base Unit	SKU: IA-UNI-B-501	PBS Biotech
Recombinant human BDNF	450-02	Peprotech
Recombinant human bFGF/FGF2	100-18B	Peprotech
Recombinant human FGF19	100-32	Peprotech
Recombinant human GDNF	450-10	Peprotech
Recombinant human SDF1	300-28A	Peprotech
ROCK inhibitor Y-27632	72302	Stem cell technologies
SB431542	S4317	Sigma
Sucrose	S7903	Sigma
SuperFrost Microscope slides	12372098	ThermoFisher	adhesion microscope slides
Tissue-Tek O.C.T. Compound	25608-930	VWR
Tris-HCL 1M	T3038-1L	Sigma
Triton X-100	9002-93-1	Sigma
Tween-20	P1379	Sigma
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	15575020	ThermoFisher