मानव प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं में चिकित्सीय एंटीबॉडी द्वारा FcγRIIIa संचालित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल यहां वर्णित है । यह कृत्रिम उत्तेजना मंच डाउनस्ट्रीम प्रभावकारक कार्यों जैसे डिग्रेनुलेशन, केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन, और बाइंडिंग में शामिल एंटीबॉडी के FcγRIIIa और एफसी भागों द्वारा मध्यस्थता किए गए संकेत रास्ते की अनुमति देता है।
चिकित्सीय एंटीबॉडी द्वारा नैदानिक प्रभावकारिता के लिए कार्रवाई का एक तंत्र प्रतिरक्षा से संबंधित कार्यों को बढ़ावा देना है, जैसे साइटोकिन स्राव और साइटोटॉक्सिटी, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं पर व्यक्त FcγRIIIa (सीडी 16) द्वारा संचालित। इन टिप्पणियों के कारण एफसी रिसेप्टर-मध्यस्थता की घटनाओं को बढ़ाने के तरीकों पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जिसमें एंटीबॉडी के एफसी हिस्से पर पाए जाने वाले फ्यूकोस मोज़िटी को हटाना शामिल है। इसके अलावा के अध्ययनों ने सिग्नलिंग, सेलुलर प्रक्रियाओं और साइटोटॉक्सिक विशेषताओं में मशीनी परिवर्तनों को स्पष्ट किया है जो afucosylated एंटीबॉडी के साथ एडीसीसी गतिविधि को बढ़ाते हैं। इसके अतिरिक्त, अन्य अध्ययनों ने छोटे अणु अवरोधकों के साथ संयोजन में इन एंटीबॉडी के संभावित लाभों को दिखाया है। इन प्रयोगों ने संयोजन सेटिंग्स में afucosylated एंटीबॉडी का उपयोग करने के लाभों को अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र का प्रदर्शन किया। इनमें से कई टिप्पणियां एक कृत्रिम इन विट्रो एक्टिवेशन परख पर आधारित थीं जिसमें मानव एनके कोशिकाओं पर FcγRIIIa चिकित्सकीय एंटीबॉडी द्वारा सक्रिय किया गया था। इस परख ने डाउनस्ट्रीम इफेक्टर एनके सेल कार्यों का अध्ययन करने की छूट प्रदान की, जैसे साइटोकिन उत्पादन और डिग्रेनुलेशन। इसके अलावा, इस परख का उपयोग सिग्नलिंग रास्तों से पूछताछ करने और उन अणुओं की पहचान करने के लिए किया गया है जिन्हें संग्राहक या बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, अन्य चिकित्सीय अणुओं (यानी, छोटे अणु अवरोधक) को सिस्टम में जोड़ा गया है ताकि चिकित्सीय एंटीबॉडी के साथ इन चिकित्सीय के संयोजन में अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके, जो वर्तमान नैदानिक अंतरिक्ष में आवश्यक है। इस पांडुलिपि का उद्देश्य इस कृत्रिम मानव एनके सेल सक्रियण परख के प्रदर्शन के लिए एक तकनीकी आधार प्रदान करना है। प्रोटोकॉल सेल सक्रियण के साथ-साथ संभावित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण चरणों को दर्शाता है जो कार्यात्मक रीडआउट से लेकर अधिक मशीनी टिप्पणियों तक होते हैं।
पिछले कुछ दशकों में, एंटीबॉडी का उपयोग कर लक्षित कैंसर चिकित्सा के विकास पर जबरदस्त ध्यान दिया गया है । ट्रैप्यूटिक एंटीबॉडी, जैसे ट्रास्टुज़ुमाब और रिटक्सीमैब, कई तंत्रों के माध्यम से काम करते हैं, जिसमें संकेत अणुओं के डामरीकरण की रोकथाम और प्रतिरक्षा प्रणाली1,2का जुड़ाव शामिल है। उत्तरार्द्ध एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी (एडीसीसी) के माध्यम से पूरा किया जाता है, जिसमें प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं नामक लिम्फोसाइट्स को एंटीबॉडी1, 2द्वारा एक लक्ष्य कोशिका में लायाजाताहै। कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ निकटता में रखकर, एनके सेल सक्रिय हो जाता है और प्रभावक अणुओं के स्राव के माध्यम से ट्यूमर/लक्ष्य कोशिका को लाइसे कर सकता है3।
आणविक स्तर पर, एंटीबॉडी का फैब हिस्सा ट्यूमर कोशिकाओं पर व्यक्त किए गए अपने कॉग्नेट एंटीजन को बांधता है, जबकि इसका एफसी हिस्सा एनके कोशिकाओं पर व्यक्त FcγRIIIa को दो कोशिकाओं को एक साथ लाने के लिए1,2संलग्न करता है। FcγRIIIa की सगाई के बाद, सिग्नलिंग पाथवे (यानी, एमएपीके और पीई 3के रास्ते) साइटोस्केलेल पुनर्व्यवस्था, साइटोकिन उत्पादन, औरसाइटोटॉक्सीसिटी4,5,6,7,8,9ड्राइव करते हैं। इस प्रकार, एडीसीसी एनके कोशिकाओं और एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता की गई एक FcγRIIIa-चालित घटना है।
क्योंकि एडीसीसी को इन चिकित्सीय एंटीबॉडी के लिए कार्रवाई का तंत्र माना जाता था, शोधकर्ताओं ने एंटीबॉडी को संशोधित करके एडीसीसी को बढ़ाने के तरीकों की खोज की । एक संशोधन शतावरी 297 से जुड़ी ओलिगोसैकराइड चेन पर फ्यूकोस को हटाना था, जो एंटीबॉडी के एफसी हिस्से की बाध्यकारी आत्मीयताको10, 11,12FcγRIIIa तक बढ़ाता है। पशु अध्ययनों में, afucosylated एंटीबॉडी प्राप्त चूहों अपने fucosylated समकक्ष13के साथ इलाज चूहों की तुलना में धीमी ट्यूमर वृद्धि का प्रदर्शन किया । इससे भी महत्वपूर्ण बात, ओबिनुतुजुमाब (उदाहरण के लिए, गजिवा, एक अनुमोदित अफ्यूकोसिलेटेड एंटीबॉडी) ने क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया या कूप लिम्फोमा14, 15के साथ निदान रोगियों में rituximab (उदाहरण के लिए, Rituxan, इसके fucosylated समकक्ष) के सापेक्ष बेहतर प्रभावकारिता दिखाई।
हाल ही में जब तक, अंतर्निहित तंत्र afucosylated एंटीबॉडी के माध्यम से एडीसीसी में वृद्धि अज्ञात थे । इस तथ्य के साथ संयुक्त कि कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए FcγRIIIa-चालित तंत्रों का उपयोग करने के लिए चिकित्सीय एंटीबॉडी विकसित करने के लिए कई शोध कार्यक्रम हैं, इन एंटीबॉडी द्वारा प्रचारित आणविक और सेलुलर पहलुओं की जांच करने वाले विट्रो परख में विकसित करना जरूरी है। यह कार्रवाई के तंत्र के साथ-साथ बायोमार्कर की खोज करने की क्षमता की मौलिक समझ प्रदान करता है। इस प्रकार, सिग्नलिंग और सेलुलर विशेषताओं के अलावा एंटीबॉडी पर निर्भर FcγRIIIa-मध्यस्थता कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक कृत्रिम सक्रियण परख विकसितकीगई थी। इन अध्ययनों के माध्यम से, afucosylated एंटीबॉडी की बढ़ी हुई प्रभावकारिता अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट किया गया है जिसमें बढ़ी हुई बाध्यकारी आत्मीयता सेलुलर गुणों और साइटोटॉक्सिक विशेषताओं को बढ़ावा देने के लिए संकेत बढ़ाती है8।
नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान प्रवृत्ति चिकित्सीय अणुओं के संयोजन का उपयोग है16. सबसे अधिक उत्परिवर्तित मार्गों में से एक PI3K मार्ग है, जिसने छोटे अणु अवरोधकों को विकसित करने में जबरदस्त प्रयास किया है जो इसमार्ग17, 18,19,20के घटकों को लक्षित करते हैं। फिर भी, ये अणु चिकित्सीय एंटीबॉडी के साथ संयोजन में कैसे कार्य करते हैं, विशेष रूप से उन संयोजनों में, जहां अवरोधक अणुओं को प्रभावित कर सकता है जिन्हें कार्य करने के लिए PI3K मार्ग की आवश्यकता होती है, जैसे चिकित्सीय एंटीबॉडी द्वारा संचालित।
इस उद्देश्य के लिए, afucosylated एंटीबॉडी अध्ययन के लिए नियोजित इन विट्रो परख का उपयोग PI3K अवरोधकों और चिकित्सीय एंटीबॉडी के संयोजन का अध्ययन करने के लिए भी किया गया है। इन अध्ययनों ने चिकित्सीय एंटीबॉडी PI3K-संचालित घटनाओं पर PI3K निषेध की आणविक विशेषताओं को परिभाषित किया और बताया कि कैसे afucosylated एंटीबॉडी9संकेत के इस नुकसान की भरपाई कर सकते हैं । ये निष्कर्ष प्रासंगिक हैं क्योंकि वे नैदानिक परीक्षणों को डिजाइन करने के लिए संभावित मार्गदर्शन देते हैं। इसके अलावा, प्रयोगों की इस श्रृंखला ने केमोकिन/साइटोकिन ट्रांसक्रिप्शन और उत्पादन को मिलाना करने के लिए PI3K सिग्नलिंग मार्ग के गतिज विनियमन के लिए पहली बार वर्णित टिप्पणियों का भी नेतृत्व किया, जो संभावित बायोमार्कर9के रूप में काम कर सकता है।
ऊपर वर्णित सिग्नलिंग और सेलुलर विशेषताओं को परिभाषित करने के लिए उपयोग की जाने वाली कृत्रिम इन विट्रो सक्रियण परख को लक्ष्य कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता की गई एनके कोशिकाओं में FcγRIIIa-चालित घटनाओं का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सिस्टम में लक्षित कोशिकाओं के बिना, देखे गए सभी सिग्नलिंग घटनाओं और कार्यों को सीधे एनके कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। प्रस्तुत परख में, एंटीबॉडी शुद्ध एनके कोशिकाओं में जोड़ा जाता है, जिस बिंदु पर एफसी भाग FcγRIIIa बांधता है। इसके बाद कोशिकाओं को कृत्रिम रूप से उत्तेजित करने के लिए एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीबॉडी को क्रॉसलिंकिंग किया जाता है। एंटीबॉडी की क्रॉसलिंकिंग लक्ष्य एंटीजन के बाध्यकारी की नकल करता है ताकि एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म उत्पन्न किया जा सके जो डाउनस्ट्रीम घटनाओं को प्रकाश में तांडव करता है। उत्तेजना की लंबाई के आधार पर, शोधकर्ता संकेत, सेलुलर प्रक्रियाओं, साइटोटॉक्सिक विशेषताओं, और प्रभावक कार्यों का आकलन कर सकते हैं8,9। इसी प्रकार, यह परख इन घटनाओं का अध्ययन करने में भी लचीलापन प्रदान करती है जब एंटीबॉडी को अन्य अणुओं के साथ जोड़ा जाता है9।
साथ में, यह चिकित्सीय एंटीबॉडी का अध्ययन करने के लिए विट्रो परख में एक आदर्श है जो कार्रवाई के तंत्र के हिस्से के रूप में एनके सेल प्रतिक्रियाओं को उनके FcγRIIIa के माध्यम से प्रकाश में लाना है। यह प्रोटोकॉल इस इन विट्रो एक्टिवेशन परख के प्रदर्शन का वर्णन करता है और विभिन्न readouts कि प्रदर्शन किया जा सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी द्वारा मध्यस्थता एनके कोशिकाओं में FcγRIIIa संचालित घटनाओं का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करता है। ये तकनीकें चिकित्सीय एंटीबॉडी की कार्रवाई के संभावित तंत्रों के मूल्यांकन की अनुमति देती हैं, जिन्हें एडीसीसी1, 2होने का सुझाव दियाजाताहै। विशेष रूप से, ये विधियां अंतर्निहित आणविक सिग्नलिंग रास्तों और सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में लचीलापन प्रदान करती हैं जो एडीसीसी के लिए जिम्मेदार हैं। वे अन्य प्रभावकार कार्यों जैसे कि केमोकिन और साइटोकिन उत्पादन के अवलोकन की भी अनुमति देते हैं। इसके अलावा, ये विधियां संभावित बायोमार्कर और अणुओं की पहचान की अनुमति देती हैं जिन्हें एडीसीसी को मिलाना लक्षित किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल का आधार लक्ष्य कोशिकाओं के अभाव में एंटीबॉडी के साथ FcγRIIIa के माध्यम से एनके कोशिकाओं की कृत्रिम उत्तेजना है। एंटीबॉडी-बाउंड लक्ष्य कोशिकाएं आमतौर पर एफसी रिसेप्टर्स के क्रॉसलिंकिंग को बढ़ावा देने के लिए एक मंच बनाने की सेवा करती हैं जो सिग्नलिंग और डाउनस्ट्रीम प्रभावों को चलाती है। इसके बजाय, एनके कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं की आवश्यकता को दरकिनार करते हुए, इस परख में एक एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी का उपयोग करके क्रॉसलिंकिंग पूरा किया जाता है। लक्ष्य कोशिकाओं के बिना, परिणाम और टिप्पणियों को सीधे एनके कोशिकाओं के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, यह मानते हुए कि शुद्धिकरण प्रक्रिया सफल है।
महत्वपूर्ण बात यह है कि एंटीबॉडी को क्रॉसलिंक करने के लिए एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी का उपयोग करना FcγRIIIa के लिए एफसी भाग की बाध्यकारी आत्मीयता में हस्तक्षेप नहीं करता है, एक बातचीत जो प्रतिक्रिया10, 11,12, 13की ताकत को तय करती है। वास्तव में, अध्ययनों से पता चला है कि 10 , 11 ,12,13FcγRIIIa के लिए उनकी बढ़ी हुई आत्मीयता के कारण Afucosylated एंटीबॉडी एडीसीसी में वृद्धि होती है । बाद के अध्ययनों से पता चला है कि यह बढ़ी हुई आत्मीयता मानव विरोधी प्रकाश श्रृंखला माध्यमिक एंटीबॉडी विकल्प से अप्रभावित है और इसका उपयोग एडीसीसी8में वृद्धि के आधार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एनके सेल को एंटीबॉडी के क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से उत्तेजित किया जाता है, दो नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल किया जाना चाहिए: 1) केवल माध्यमिक एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी के बिना चिकित्सीय एंटीबॉडी, और 2) माध्यमिक एंटी-ह्यूमन एन लाइट चेन एंटीबॉडी केवल। दोनों ही मामलों में, कोई सिग्नलिंग या प्रभावक कार्य उत्पन्न नहीं किया जाना चाहिए।
यह विधि छोटे अणु अवरोधकों पर चिकित्सीय एंटीबॉडी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए लचीलापन भी प्रदान करती है। अवरोधक को माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ क्रॉसलिंकिंग से पहले जोड़ा जा सकता है ताकि अवरोधक के पास अपने लक्ष्य को संलग्न करने का समय हो। हालांकि, अवरोधक पूर्व उपचार के इष्टतम समय को निर्धारित करने के लिए अध्ययन किए जाने चाहिए; इस प्रकार, अवरोधक उत्तेजना पर एक अधिकतम प्रभाव पड़ता है। के साथ कि कहा, शोधकर्ताओं ने भी उत्तेजना के बाद एक अवरोधक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चुन सकते हैं । इस मामले में, अवरोधक को यह अध्ययन करने के लिए क्रॉसलिंकिंग के बाद जोड़ा जा सकता है कि यह पहले से उत्पन्न संकेतों और प्रक्रियाओं को कैसे प्रभावित करता है। साथ में, यहां वर्णित विधि चिकित्सीय एंटीबॉडी के साथ विभिन्न छोटे अणु अवरोधकों के संयोजन प्रभावों का अध्ययन करने में अधिकतम लचीलापन प्रदान करती है।
जैसा कि ऊपर बताया गया है, उत्तेजना के बाद विभिन्न प्रकार के रीडआउट किए जा सकते हैं। विभिन्न विक्रेताओं से एसडीएस-पेज और झिल्ली हस्तांतरण प्रणालियों का उपयोग करके सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग किया जा सकता है। इसी तरह, जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन विभिन्न आरएनए निष्कर्षण विधियों, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएजेंट्स और जीन अभिव्यक्ति उपकरणों का उपयोग करके भी किया जा सकता है। अंत में, इंट्रासेलुलर या एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन के लिए धुंधला भी किया जा सकता है जिसमें नमूनों का विश्लेषण विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके किया जा सकता है। इंट्रासेलुलर साइटोकिन और सीडी 107ए धुंधला (चरण 3.4, जिसका मूल्यांकन एक साथ किया जा सकता है) के लिए, सिग्नल को अधिकतम करने के लिए मोनेंसिन और/या ब्रेफेल्डिन ए जोड़ा जाना चाहिए। हमने प्रत्येक प्रयोगात्मक लक्ष्य के लिए विभिन्न प्लेटफार्मों का उपयोग किया है और अभी भी समान परिणाम देखे हैं। इसलिए, अध्ययन के आधार पर विधि को विभिन्न अभिकर् ती, प्लेटफार्मों और उपकरणों के साथ पूरित किया जा सकता है।
उत्तेजना के लिए क्रॉसलिंकिंग समय अध्ययन के लक्ष्य पर निर्भर करेगा। यदि सिग्नलिंग अध्ययन वांछित हैं, तो विशिष्ट क्रॉसलिंकिंग उत्तेजना समय 2 मिनट और 10 मिनट के बीच है। pAKT, pPRAS40, और pERK1/2 संचय चोटियों पर 2 मिनट और 10 मिनट8, 9के बाद गायब होजाताहै। कार्यात्मक अध्ययनों के लिए (यानी, केमोकिन/साइटोकिन उत्पादन से जुड़े लोग), कोशिकाओं को कम से कम 30 मिनट के लिए उत्तेजित किया जाना चाहिए, जो विश्लेषण9पर निर्भर करता है। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण भी आम तौर पर उत्तेजना9के 30 मिनट की आवश्यकता है । एक readout के रूप में RANTES जीन अभिव्यक्ति का उपयोग करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए, क्योंकि RANTES mRNA उत्पादन ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण से स्वतंत्र है क्योंकि यह पहले से ही उत्तेजना25पर प्रोटीन के त्वरित अनुवाद और रिहाई के लिए कोशिकाओं में संग्रहीत किया जाता है। इसके विपरीत, डेग्रेशन को कम से कम 3 घंटे की उत्तेजना की आवश्यकता होती है। इन सामान्य टिप्पणियों के बावजूद, शोधकर्ताओं को ब्याज के विशेष अणुओं के लिए इष्टतम उत्तेजना समय निर्धारित करने के लिए गतिज अध्ययन करना चाहिए।
इसी तरह, शोधकर्ताओं को इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ब्याज की एंटीबॉडी को कम करना चाहिए क्योंकि विभिन्न विशिष्टताओं वाले एंटीबॉडी विभिन्न समानताओं के साथ FcγRIIIa के लिए बाध्य करते हैं, भले ही वे एक ही आइसोटाइप के हों। उदाहरण के लिए, रिटक्सीमाब और ट्रास्टुज़ुमाब दोनों एक इग्जी 1 आइसोटाइप हैं लेकिन ट्रास्टुज़ुमाब रितुक्सीमाब26, 27की तुलना में FcγRIIIa के वलिन बहुरूपता के लिए अधिक दृढ़ता से बांधता है। आत्मीयता में यह अंतर कार्यात्मक मतभेदों का कारण बन सकता है, जैसे कि डीग्रेनुलेशन, जैसा कि प्रकाशित अध्ययनों में8में देखा गया है।
इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीबॉडी के एफसी हिस्से में FcγRIIIa के लिए कम आत्मीयता है। इसके परिणामस्वरूप एंटीबॉडी को धोना पड़ सकता है क्योंकि प्रोटोकॉल में एफसी रिसेप्टर को एंटीबॉडी के बाध्यकारी होने के बाद धोने के कदम शामिल हैं। यह तो परख में संवेदनशीलता की कमी के रूप में उत्तेजना के बाद CD107a सकारात्मक कोशिकाओं के कम प्रतिशत द्वारा सुझाव दिया जासकता है (चित्रा 5)। हालांकि, इष्टतम एकाग्रता के निर्धारण को विश्वास प्रदान करना चाहिए कि परिणाम संवेदनशीलता की कमी के कारण नहीं हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं को जैव रासायनिक और कार्यात्मक परख में स्पष्ट रूप से सक्रिय किया जाता है जो एकल सेल रीडआउट(चित्रा 2, चित्र 3, चित्र 6)के विपरीत थोक सेल का उपयोग करते हैं।
प्रोटोकॉल भी सीमित है क्योंकि यह पूरी तरह से नकल नहीं करता है जो शारीरिक रूप से होता है। माध्यमिक मानव विरोधी कश्मीर एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं पर व्यक्त लक्ष्य एंटीजन द्वारा उत्पन्न क्रॉसलिंकिंग की नकल करना है। यहां, अधिकतम प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी की संतृप्त राशि जोड़ी जाती है। हालांकि, अलग लक्ष्य कोशिकाएं एंटीजन के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करेंगी, जो क्रॉसलिंकिंग और प्रतिक्रिया को प्रभावित करेंगी । वर्तमान में, इस प्लेटफ़ॉर्म को विभिन्न एंटीजन अभिव्यक्ति स्तरों के प्रभावों की नकल करने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है।
इन प्रयोगों को करते समय विचार करने वाला एक अन्य कारक व्यक्तियों के बीच विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और प्रतिरक्षात्मक इतिहास के कारण दाता-से-दाता परिवर्तनशीलता है। इसलिए, एक ही परक में विभिन्न दानदाताओं से एनके सेल प्रतिक्रियाओं की तुलना करते समय देखभाल की जानी चाहिए। इसी प्रकार, जब विभिन्न दानदाताओं का उपयोग किया जाता है तो केवल सामान्य निष्कर्ष दिए जाने चाहिए ।
कुल मिलाकर, वर्णित विधि एनके कोशिकाओं में एंटीबॉडी संचालित FcγRIIIa-मध्यस्थता घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल और लचीला उत्तेजना मंच है। इसका उपयोग बढ़ी हुई एडीसीसी और अफ्यूकोसिलेटेड एंटीबॉडी 8 के साथ देखी गई प्रभावकारिता के आधार को बेहतरढंगसे समझने के लिए किया गया है । इस विधि को चिकित्सीय एंटीबॉडी और PI3K छोटे अणु अवरोधकों के संयोजन के अध्ययन में भीनियोजितकिया गया था । इसके अतिरिक्त, PS6 द्वारा विनियमित केमोकिन और साइटोकिन उत्पादन के लिए पहले से अज्ञात तंत्र की पहचानकीगई थी। इसलिए, इस कृत्रिम सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके भविष्य के अध्ययन FcγRIIIa द्वारा संचालित प्रभावकार कार्यों के लिए विनियमन के तंत्र को और स्पष्ट कर सकते हैं। यह भी संभावित इन तंत्रों के लिए महत्वपूर्ण नए अणुओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात अणुओं के लिए नई भूमिकाओं की पहचान कर सकते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस पांडुलिपि की टिप्पणियों और संपादन के लिए जेम्स ली और क्रिस्टोफर एनजी का शुक्रिया अदा करते हैं ।
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |