Summary
İnsan doğal öldürücü hücrelerindeki terapötik antikorlar tarafından FcφRIIIa güdümlü olayları incelemek için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu yapay stimülasyon platformu, degranülasyon, kemokin/sitokin üretimi gibi aşağı akış efektör fonksiyonlarının ve bağlamada yer alan antikorların FcφRIIIa ve Fc bölümlerinin aracılık ettiği sinyal yollarının sorgulenmesine izin verir.
Abstract
Terapötik antikorlar tarafından klinik etkinlik için bir etki mekanizması, doğal öldürücü (NK) hücreler üzerinde ifade edilen FcφRIIIa (CD16) tarafından yönlendirilen sitokin salgılanması ve sitotoksiklik gibi bağışıklıkla ilgili fonksiyonların teşvik edilmesidir. Bu gözlemler, antikorun Fc kısmında bulunan bir fucose moiety'nin kaldırılmasını içeren Fc reseptör aracılı olayları artırma yöntemlerine odaklanan araştırmalara yol açmıştır. Daha fazla çalışma, afukosillenmiş antikorlarla ADCC aktivitesini artıran sinyalizasyon, hücresel süreçler ve sitotoksik özelliklerdeki mekanistik değişiklikleri aydınlattı. Ek olarak, diğer çalışmalar bu antikorların küçük molekül inhibitörleri ile birlikte potansiyel faydalarını göstermiştir. Bu deneyler, kombinasyon ayarlarında afukosillenmiş antikorların kullanılmasının altında kalan moleküler ve hücresel mekanizmaları göstermiştir. Bu gözlemlerin çoğu, insan NK hücreleri üzerindeki FcφRIIIa'nın terapötik antikorlar tarafından aktive edildiği yapay bir in vitro aktivasyon testine dayanıyordu. Bu test, sitokin üretimi ve degranülasyon gibi aşağı akış efektörü NK hücre fonksiyonlarını inceleme esnekliği sağladı. Ek olarak, bu test sinyal yollarını sorgulamak ve modüle edilebilen veya biyobelirteç olarak kullanılabilen molekülleri tanımlamak için kullanılmıştır. Son olarak, bu terapötiklerin mevcut klinik alanda gerekli olan terapötik antikorlarla kombinasyonu hakkında fikir vermek için sisteme diğer terapötik moleküller (yani küçük molekül inhibitörleri) eklenmiştir. Bu makale, bu yapay insan NK hücre aktivasyon testsini gerçekleştirmek için teknik bir temel sağlamayı amaçlamaktadır. Protokol, hücre etkinleştirme için önemli adımların yanı sıra işlevsel okumalardan daha mekanistik gözlemlere kadar değişen potansiyel aşağı akış uygulamalarını gösterir.
Introduction
Son birkaç on yılda, antikorlar kullanılarak hedefe yönelik kanser tedavileri geliştirmeye büyük bir odaklanma olmuştur. Trastuzumab ve rituksimab gibi terapötik antikorlar, sinyal moleküllerinin karartılmış etmenin önlenmesi ve bağışıklık sisteminin harekete geçirilmesi de dahil olmak üzere birden fazla mekanizma ile çalışır1,2. İkincisi, doğal öldürücü (NK) hücreler adı verilen lenfositlerin antikor1,2tarafından hedef hücreye getirildiği antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) ile gerçekleştirilir. Hücreleri birbirine yakın yerleştirerek, NK hücresi aktive edilir ve efektör moleküllerin salgılanması yoluyla bir tümör / hedef hücreyiüzebilir 3.
Moleküler düzeyde, antikorun Fab kısmı tümör hücreleri üzerinde ifade edilen konyak antijenini bağlarken, Fc kısmı iki hücreyi bir araya getirmek için NK hücreleri üzerinde ifade edilen FcφRIIIa'yı1,2ile bağlar. FcφRIIIa'nın katılımından sonra, sinyal yolları (yani MAPK ve PI3K yolları) sitoskeletal yeniden düzenleme, sitokin üretimi ve sitotoksisite 4 , 5,6,7,8,9' u yönlendirmektedir. Bu nedenle, ADCC, NK hücreleri ve antikorların aracılık ettiği FcφRIIIa odaklı bir olaydır.
ADCC'nin bu terapötik antikorlar için bir etki mekanizması olduğu düşünülmüş olduğundan, araştırmacılar antikoru değiştirerek ADCC'yi artırmak için yöntemler aradılar. Bir değişiklik, asparagine 297'ye bağlı oligosakkarit zincirindeki fukozun çıkarılmasıydı, bu da antikorun Fc kısmının FcφRIIIa10 , 11,12'yebağlanma yakınlığını arttırır. Hayvan çalışmalarında, afukosillenmiş antikor alan fareler, fucosylated muadili13ile tedavi edilen farelere kıyasla daha yavaş tümör büyümesi gösterdi. Daha da önemlisi, kronik lenfositik lösemi veya foliküler lenfoma tanısı alan hastalarda obinutuzumab (örneğin, onaylanmış bir afukosillenmiş antikor olan Gazyva) rituksimab'a (örneğin, Rituxan, fukosillenmiş muadili) göre daha iyi etkinlikgöstermiştir.
Yakın zamana kadar, afukosillenmiş antikorlar yoluyla ADCC'nin altında kalan mekanizmalar bilinmiyordu. Kanser hücrelerini hedeflemek için FcφRIIIa güdümlü mekanizmaları kullanmak için terapötik antikorlar geliştiren çok sayıda araştırma programı olduğu gerçeğiyle birlikte, bu antikorların teşvik ettiği moleküler ve hücresel yönleri inceleyen in vitro tahliller geliştirmek zorunludur. Bu, etki mekanizmalarının temel olarak anlaşılmasını ve biyobelirteçleri keşfetme potansiyelini sağlar. Bu nedenle, sinyalizasyon ve hücresel özelliklere ek olarak antikora bağımlı FcφRIIIa aracılı işlevleri incelemek için yapay bir aktivasyon testi geliştirilmiştir8. Bu çalışmalarla, afukosillenmiş antikorların etkinliğinin artmasının altında bulunan mekanizmalar, hücresel özellikleri ve sitotoksik özellikleri teşvik etmek için gelişmiş bağlama benzeşiminin sinyalizasyonun arttığı ortaya çıkarılmıştır8.
Klinik çalışmalarda mevcut eğilim terapötik moleküllerin bir kombinasyonunun kullanılmasıdır16. En sık mutasyona uğrayan yollardan biri PI3K yoludur, bu da bu yolun bileşenlerini hedefleyen küçük molekül inhibitörleri geliştirmede muazzam çabaya yol açmıştır17,18,19,20. Bununla birlikte, bu moleküllerin terapötik antikorlarla birlikte nasıl hareket ettiği, özellikle inhibitörün terapötik antikorlar tarafından yönlendirilenler gibi çalışması için PI3K yolunu gerektiren molekülleri etkileyebileceği kombinasyonlarda nispeten bilinmemektedir.
Bu amaçla, afukosillenmiş antikor çalışmaları için kullanılan in vitro tahlil, PI3K inhibitörleri ve terapötik antikorların kombinasyonunu incelemek için de kullanılmıştır. Bu çalışmalar PI3K inhibisyonunun terapötik antikor PI3K güdümlü olaylar üzerindeki moleküler özelliklerini tanımladı ve afukosillenmiş antikorların bu sinyal kaybını nasıl dengeleyebileceğini tanımladı9. Bu bulgular, klinik çalışmaların tasarlanması için potansiyel rehberlik verdikleri için önemlidir. Ek olarak, bu deneyler serisi ayrıca pi3K sinyal yolunun kinetik regülasyonu için ilk açıklanan gözlemlere yol açtı kemokin / sitokin transkripsiyonunu ve üretimini modüle etmek için potansiyel biyobelirteçler olarak hizmet edebilir9.
Yukarıda açıklanan sinyalizasyon ve hücresel özellikleri tanımlamak için kullanılan yapay in vitro aktivasyon testi, hedef hücrelerin yokluğunda antikorların aracılık ettiği NK hücrelerindeki FcφRIIIa güdümlü olayları incelemek için tasarlanmıştır. Sistemdeki hedef hücreler olmadan, gözlemlenen tüm sinyal olayları ve işlevleri doğrudan NK hücrelerine atfedilebilir. Sunulan testte, saflaştırılmış NK hücrelerine antikor eklenir, bu noktada Fc kısmı FcφRIIIa'yı bağlar. Bunu, hücreleri yapay olarak uyarmak için anti-insan φ ışık zinciri antikor kullanılarak antikorun çapraz bağlantısı takip eder. Antikorun çapraz bağlanması, aşağı akış olaylarını ortaya çıkarmak için bir sinyal platformu oluşturmak için hedef antijenin bağlanmasını taklit eder. Stimülasyonun uzunluğuna bağlı olarak, araştırmacılar sinyalizasyon, hücresel süreçler, sitotoksik özellikler ve efektör fonksiyonları8,9. Benzer şekilde, bu test ayrıca antikorlar diğer moleküllerle birleştirildiğinde bu olayları çalışmada esneklik sağlar9.
Birlikte, bu, etki mekanizmasının bir parçası olarak FcφRIIIa'ları aracılığıyla NK hücre yanıtlarını ortaya çıkan terapötik antikorları incelemek için ideal bir in vitro testtir. Bu protokol, bu in vitro aktivasyon testinin performansını açıklar ve gerçekleştirilebilecek çeşitli okumalar hakkında bilgi sağlar.
Protocol
Aşağıdaki protokol, iQ Bioscience'ın insan araştırma etik komitesinin yönergelerine uygundur.
1. PBMC'lerin izolasyonu ve NK hücrelerinin zenginleştirilmesi/saflaştırılması
NOT: Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC' ler) izolasyonu ve zenginleştirme/saflaştırma için diğer yöntemler de yapılabilir.
- Düzenlenmiş koşullar altında heparin içeren bir tüpe 200 mL kan çekin.
- Gözenekli bir bariyer içeren 50 mL'lik bir tüpe 15 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin. Tüpü 30 s için 1000 x g'da döndürün.
- Tüpe 12,5 mL kan ekleyin ve ardından 12,5 mL pbs ekleyin ve 3x'i hafifçe ters çevirin. Tüpü 800 x g'da oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca kırılmadan döndürün.
- Hücreler dönerken gözenekli bariyerli her tüp için 40 mL PBS'li 50 mL konik bir tüp hazırlayın.
- Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjden sonra inceleyin. 50 mL'lik tüpteki 20 mL ve 25 mL sınırlayıcılar arasında gözenekli bariyerin üzerinde ince, gözle görülür beyaz bir PBMC katmanı olup olmadığını kontrol edin.
- İnce, beyaz PBMC tabakasını bozmadan pipet kullanarak üstten mümkün olduğunca fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın.
- Temiz bir 10 mL serolojik pipetle, pbmc tabakasını, berrak, sarımsı sıvı tabakasına ek olarak tüpün filtresine kadar hafifçe çıkarın.
- PBMC'leri ve sıvıyı adım 1.4'te hazırlanan PBS içeren 50 mL konik içine atın. RT'de spin tüpleri ve 5 dakika boyunca 300 x g.
- PBS yıkamayı aspire edin ve ek bir 40 mL PBS ekleyin. RT'de spin tüpleri ve 5 dakika boyunca 300 x g.
- Yıkadıktan sonra, hücreleri sayın ve 1 x 107 hücre başına% 2 BSA / PBS'nin 40 μL'sinde yeniden biriktirin.
- Tercih edilen yöntemi kullanarak NK hücrelerinin yalıtımine geçin. Seçenekler arasında manuel veya otomatik manyetik boncuk tabanlı sıralama9,21 bulunur. Floresan ile aktive hücre sıralama da yapılabilir22.
- Akış sitometrisi ile NK hücrelerinin saflığını belirlemek için küçük bir hücre aliquot'u çıkarın. Gating stratejisi aşağıdakileri içerir: ileriye ve yan dağılım profiline dayalı canlı hücreler üzerindeki kapı, daha sonra belirli canlı popülasyondaki NK işaretleyicilerine (örneğin, CD3, CD56) göre saflığı değerlendirin. Tipik saflık %>95'tir.
- İzolasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri RT'de döndürün ve pelet ve aspirasyon için 5 dakika boyunca 300 x g çevirin.
- Hücre peletini besinlerle RPMI 1640'ta 1 x10 7 hücre/mL'ye, %10 ısı inaktive FBS'ye, 1 mM sodyum piruvata, 55 mM 2-ME'ye ve 10 mM HEPES'e (pH = 7.2) yeniden harcayın.
2. FcφRIIIa aracılığıyla NK hücrelerinin antikor aracılı aktivasyonu
- Soğutmalı bir mikrosantrifüjü 4 °C'ye ayarlayın.
- Yeniden biriktirilmiş 1 x 106 (100 μL) NK hücrelerini 1,5 mL'lik tüplere dağıtın ve buza yerleştirin.
NOT: Çok sayıda numune varsa hücreler 96 kuyu U-alt plakaya dağıtılabilir. - Numune başına 1 μL 100 μg/mL rituksimab (veya ilgi antikoru) hazırlayın ve 1 μg/mL antikorun son konsantrasyonu için hücrelere 1 μL ekleyin.
NOT: Kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi için bu noktada veya daha erken zamanda hücrelere başka moleküller eklenebilir. Burada ritixumab stimülasyon için kullanıldı. Daha önceki çalışmalarda, stimülasyonlara küçük molekül inhibitörleri eklenmiştir9. - Numuneyi 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, ortamda örnek başına 50 μg/mL anti-insan φ ışık zinciri antikorunu hazırlayın ve bir ısı bloğunda veya su banyosunda 37 °C'ye kadar ısıtın.
- Buzdaki hücrelerin inkübasyonundan sonra, 1 mL buz gibi ortam ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün. 1 mL buz soğuk medya ile tekrar yıkayın.
- Son yıkamadan sonra süpernatantı aspire edin ve adım 2.5'te hazırlanan anti-insan φ hafif zincir karışımının 50 μL'lik kısmını ekleyin.
- Son kullanıcı için numuneleri hemen bir ısı bloğunda veya bir su banyosunda 37 °C'de belirlenen zaman noktalarında kuluçkaya yatırın.
- 1 mL buz gibi ortam ekleyerek uyarımı durdurun ve numuneleri 5 dakika boyunca 135 x g'da soğutulmuş bir santrifüjde hemen döndürün. 1 mL buz gibi ortamla bir kez daha yıkayın.
3. Aşağı akış uygulamaları ve okumaları
- FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerindeki sinyal moleküllerinin batı blot analizi ile sorgulanarak sorgulandırılması
NOT: Farklı protein ayırma ve membran transfer aparatları kullanılabilir.- Buz gibi ortamla son yıkamadan sonra (adım 2.8), fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren 20 μL RIPA tamponlu lyse hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca karışır.
- 2100 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca döndürme tüpleri. Lisat temiz bir 1,5 mL tüpe aktarın ve protein ayırma için gerekli reaktifleri ekleyin.
- SDS-PAGE jel üzerindeki proteinleri ayırın ve standart protokolleri izleyerek bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın.
- Birincil algılama antikoru için üreticinin veri sayfasına göre membranı bloke edin ve araştırın (burada pAKT, pPRAS 40 ve pERK1/2 kullanılmıştır).
- PVDF membranında üreticinin önerilerine göre HRP konjuge ikincil antikor ve chemiluminescence reaktif ekleyin. Görselleştirmek için X-ray film veya algılama cihazı kullanın (burada, pAKT 60 kDa'da, pPRAS40 40 kDa'da ve pERK1/2 42 kDa ve 44 kDa'da tespit edildi).
- mRNA'nın izolasyonu ve FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinin gen ekspresyonanalizinehazırlık ( Malzeme Tablosu )
- Stimülasyon için zaman noktasına ulaşıldıktan sonra (adım 2.7), tüpü buza yerleştirin ve hemen 5 dakika boyunca 135 x g'da (adım 2.8'e benzer) soğutmalı bir santrifüjde döndürün.
- Üst kısmı çıkarın ve 1 mL buz gibi PBS ile 2x yıkayın.
- Guanidium izotiyosiyanat RNA ekstraksiyonu kullanan Lyse hücreleri (Malzeme Tablosu). Ticari bir kit(Malzeme Masası)ile rastgele altıgenler kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirmek için 1 μg mRNA kullanın.
NOT: RNA ekstraksiyonu veya cDNA sentezinin herhangi bir yöntemi9, 23,24kullanılabilir. - Gen ekspresyon analizine kadar cDNA'yı -20 °C'de dondurun.
- FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinde sitoskeletal yeniden düzenleme değerlendirmesi
- Buz gibi ortamla son yıkamadan sonra (adım 2.8), hücre peletini RT'de 10 dakika boyunca 50 μL% 3.7 paraformaldehit ile yeniden depola.
- 1 mL PBS ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün.
- Hücrelerin dengesini sağlamak için 5 dakika boyunca %0,1 Triton X-100/PBS'nin 100 μL'sini ekleyin ve 135 x g'daki hücreleri 5 dakika boyunca RT'de peletleyin.
- %1 BSA/PBS'de seyreltilmiş 100 μL 5 birim/mL AF488 etiketli phalloidin ekleyin ve RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- 1 mL PBS ekleyin ve yıkamak için RT'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün. Akış sitometrik analizi için hücre peletini istenen hacimde yeniden diriltin.
- CD107a yüzey boyama kullanılarak FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinin degranülasyonunun değerlendirilmesi
- 2.1–2.4 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri buz üzerindeki ilgi antikor ile kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, numune başına 50 μL antikor karışımı hazırlayın. Karışımı hücre ortamlarında 50 μg/mL anti-insan φ hafif zincir antikoru ve 1 μg/mL florokrom etiketli CD107a ile hazırlayın.
- Hücrelerin buz üzerinde inkübasyonundan sonra, 1 mL buz gibi ortam ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün, ardından 1 mL buz soğuk ortamı ile tekrar yıkayın.
- Son yıkamadan sonra süpernatantı aspire edin, ardından anti-insan φ hafif zincir karışımından 50 μL ekleyin ve istenen zaman noktaları için 37 °C'de kuluçkaya yatın.
- İstediğiniz zaman noktalarında, 1 mL PBS ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün. RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 1 mL PBS ekleyin ve yıkamak için RT'de 5 dakika boyunca 135 x g'da döndürün. Akış sitometrik analizi için hücre peletini istenen hacimde yeniden diriltin.
- FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinden kemokin/sitokin üretiminin değerlendirilmesi
NOT: Kemokin ve sitokin üretiminin değerlendirilmesi için farklı yöntemler ve/veya kitler kullanılabilir.- Stimülasyon için zaman noktasına ulaşıldıktan sonra (adım 2.7), tüpü hemen buza yerleştirin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 135 x g'da soğutmalı bir santrifüjde döndürün.
- Süpernatant temiz bir gemiye aktarın. İstenilen tahlil kullanarak kemokin veya sitokin değerlendirmesine kadar süpernatant dondurun.
NOT: Hücre peletleri artık buz gibi PBS ile yıkanabilir ve sinyalizasyon, gen ekspresyolojisi ve sitoskeletal yeniden düzenleme çalışmaları için işlenebilir.
Representative Results
Antikorların Fc kısmı monositler gibi diğer hücre tiplerinde ifade edilen FcφRIIIa'yı bağlayabildiğinden, NK hücre saflığının yüksek olması önemlidir. Yüksek saflıkta, yapılan gözlemler doğrudan NK hücrelerindeki FcφRIIIa odaklı olaylara bağlanabilir. Burada, NK hücreleri CD56 ve CD3 lekelerine dayanarak% 90'dan fazla saflığa sahipti (Şekil 1). Buna ek olarak, canlılık% >95 idi. İzolasyonlar daha düşük canlılıkla kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Olayların FcφRIIIa tarafından yönlendirildiğinden emin olmak için, fosfo-AKT (pAKT), fosfo-PRAS40 (pPRAS40) ve fosfo-ERK1/2 (pERK1/2) için batı lekeleri gerçekleştirildi ve NK hücreleri 1-5 dakika boyunca aktive edildi. Gösterildiği gibi, bu moleküllerin birikmesi gözlenmiştir (Şekil 2). Benzer şekilde, aktif NK hücreleri gen ekspresyon analizinde gösterildiği gibi MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ ve TNF-α ifade etti (Şekil 3).
Ayrıca aktif hücrelerde sitoskeletal yeniden düzenleme gözlenmiştir(Şekil 4). Hücre yüzeyinde 4 saat ifade edilen CD107a için uyarılan NK hücrelerinin yüzdesi (Şekil 5). Ayrıca, süpernatantta 3 saat stimülasyondan sonra IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β ve RANTES tespitedilmiştir (Şekil 6). Aktif NK hücreleri bu fosforilasyonlu proteinlere, ayrıca bahsedilen kemokinlerin ve sitokinlerin gen ekspresyoyon ve üretimine sahip olacağından, bu okumalar yayınlanan çalışmalara dayanarak beklenmektedir8,9. Tüm deneylerde, stimülasyon koşulları anti-insan φ ışık zinciri sadece kontrol ve anti-insan φ ışık çapraz bağlama kontrolü olmadan antikor içermelidir. Bu NK hücreleri herhangi bir fosfo-sinyal, degranülasyon, kemokin/sitokin üretimi veya kemokin/sitokin gen ekspresyasyonu göstermemelidir.
Şekil 1: PBMC'lerden yalıtımdan sonra NK hücre saflığının temsili akış profilleri. PBMC'ler sağlıklı bir donörün kanından izole edildi, ardından insan NK hücre izolasyonu için negatif bir seçim yöntemi kullanılarak NKhücrelerininzenginleştirilmesi ( Malzeme Tablosu ). Hücreler saflığı belirlemek için zenginleşmeden önce ve sonra CD56 ve CD3 ile boyandı. İzolasyondan önce ve sonra CD56 ve CD3'ün temsili nokta çizimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FCφRIIIa ile aktive edilen NK hücreleri fosforilasyonlu sinyal molekülleri sergiler. Hücreler rituksimab ile 2 dakika uyarılmış ve protokole göre hücre lysates yapılmıştır. Lysates% 4-12 jel üzerinde ayrıldı, ardından bir PVDF membranına transfer edildi. Membran pAKT, pPRAS40, pERK1/2 ve aksin karşı antikorlarla araştırıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FCφRIIIa ile aktive edilen NK hücreleri kemokin ve sitokin genlerini ifade eder. NK hücreleri 0 h, 0,5 saat ve 1 h için rituksimab ile uyarıldı, ters yazıldı ve MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ ve TNF-α(Malzeme Masası)için qPCR analizine tabi tutuldu. (A) Her zaman noktasında MIP-1α, MIP-1β ve RANTES'in göreli ifadesi. (B) Her zaman noktasında IFN-γ ve TNF-α göreli ifadesi. Değerler akrin genine normalleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FcφRIIIa ile aktive edilen NK hücreleri sitoskeletal yeniden düzenleme sergiler. NK hücreleri 0 dk, 5 dk, 15 dk ve 30 dk rituksimab ile uyarılmış, ardından phalloidin boyama ve akış sitometrisi ile sitoskeletal yeniden düzenleme için değerlendirme yapıldı. Deneysel zaman noktasında MFI'nin rituksimab (daire, katı çizgi) veya ikincil antikor (kare, noktalı çizgi) ile uyarılan NK hücrelerinin 0'ında MFI'ye oranı. Çubuklar dört çoğaltmanın SD'sini temsil eder. Yıldız işaretleri, iki kuyruklu eşleşmeyen bir Öğrencinin t testini temel alan istatistiksel önemi temsil eder (*p < 0,05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: FCφRIIIa ile aktive edilen NK hücreleri CD107a'yı ifade eder. NK hücreleri rituksimab ile 4 saat boyunca uyarıldı ve ardından CD107a ve akış sitometrisi ile degranülasyon değerlendirmesi yapıldı. (A) 0 h ve 4 h için rituksimab (beyaz çubuklar) veya anti-insan φ hafif zincir antikor (gri çubuklar) ile uyarılma sonrası CD107a'yı ifade eden NK hücrelerinin yüzdesi (B) Rituximab (beyaz çubuklar) veya anti-insan φ hafif zincir antikor (gri çubuklar) ile uyarılan NK hücrelerinin 0 h ve 4 h. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: FcφRIIIa ile aktive edilen NK hücreleri kemokin ve sitokin salgılar. NK hücreleri rituksimab ile 0, 0.5, 1, 3 ve 6 saat boyunca uyarıldı. Supernatant, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ ve TNF-α akış ve boncuk bazlı sitokin değerlendirme yöntemiyle(Malzeme Tablosu) salınımınıölçmek için toplanmıştı. (A) Her zaman noktasında MIP-1α, MIP-1β ve RANTES üretimi. (B) IFN-γ ve TNF-α üretimi her zaman noktasında. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, antikorların aracılık ettiği NK hücrelerinde FcφRIIIa güdümlü olayları inceleme yöntemlerini açıklar. Bu teknikler, ADCC1,2olduğu öne sürülen terapötik antikorların potansiyel etki mekanizmalarının değerlendirilmesine izin vermektedir. Özellikle, bu yöntemler ADCC'den sorumlu olan temel moleküler sinyal yollarını ve hücresel süreçleri incelemede esneklik sağlar. Ayrıca kemokin ve sitokin üretimi gibi diğer efektör fonksiyonlarının gözlemlenmesine izin verirler. Ek olarak, bu yöntemler ADCC'yi modüle etmek için hedeflenebilecek potansiyel biyobelirteçlerin ve moleküllerin tanımlanmasına izin verir.
Bu protokolün temeli, NK hücrelerinin FcφRIIIa aracılığıyla hedef hücrelerin yokluğunda antikorlarla yapay uyarılmasıdır. Antikora bağlı hedef hücreler tipik olarak Fc reseptörlerinin çapraz bağlanmasını teşvik ederek sinyal ve aşağı akış etkilerini yönlendiren bir platform oluşturur. Bunun yerine, çapraz bağlama, bu testte bir anti-insan φ ışık zinciri antikor kullanılarak gerçekleştirilir ve NK hücrelerini uyarmak için hedef hücrelere olan ihtiyacı atlar. Hedef hücreler olmadan, saflaştırma işleminin başarılı olduğu varsayılarak sonuçlar ve gözlemler doğrudan NK hücrelerine atfedilebilir.
Daha da önemlisi, antikorun çapraz bağlantısı için anti-insan φ ışık zinciri antikorunun kullanılması, 10 , 11,12,13tepkisinin gücünü belirleyen bir etkileşim olan FcφRIIIa için Fc bölümünün bağlayıcı benzeşimine müdahale etmez. Gerçekten de, çalışmalar afukosillenmiş antikorların FcφRIIIa10 , 11 , 12,13için artan benzeşimleri nedeniyle ADCC'yi artırdığını göstermiştir. Daha sonraki çalışmalar, bu artan benzeşimin anti-insan φ ışık zinciri ikincil antikor ikamesinden etkilenmediğini ve artan ADCC 8'in temelini incelemek için kullanılabileceğinigöstermiştir. NK hücresinin antikorun çapraz bağlantısı yoluyla uyarılmasını sağlamak için iki negatif kontrol dahil edilmelidir: 1) terapötik antikor sadece ikincil anti-insan φ ışık zinciri antikor olmadan ve 2) ikincil anti-insan φ hafif zincir antikor sadece. Her iki durumda da sinyal veya efektör fonksiyonu oluşturulmamalıdır.
Bu yöntem ayrıca terapötik antikorların küçük molekül inhibitörleri üzerindeki etkilerini incelemek için esneklik sağlar. inhibitör ikincil antikorla çapraz bağlantı kurmadan önce eklenebilir, böylece inhibitör hedefini meşgul etmek için zamana sahip olur. Bununla birlikte, inhibitör ön işlem süresinin en uygun zamanını belirlemek için çalışmalar yapılmalıdır; böylece inhibitör stimülasyon üzerinde maksimum etkiye sahiptir. Bununla birlikte, araştırmacılar stimülasyondan sonra bir inhibitörün etkilerini incelemeyi de seçebilirler. Bu durumda, inhibitör çapraz bağlantıdan sonra, zaten oluşturulan sinyalleri ve süreçleri nasıl etkilediğini incelemek için eklenebilir. Burada açıklanan yöntem birlikte, farklı küçük molekül inhibitörlerinin terapötik antikorlarla kombinatoryal etkilerinin incelenmesinde maksimum esneklik sağlar.
Yukarıda belirtildiği gibi, stimülasyondan sonra çeşitli okumalar yapılabilir. Batı blotting çeşitli satıcılardan SDS-PAGE ve membran transfer sistemleri kullanarak sinyal çalışması için yapılabilir. Benzer şekilde, gen ekspresyonu çeşitli RNA ekstraksiyon yöntemleri, ters transkripsiyon reaktifleri ve gen ekspresyon araçları kullanılarak da değerlendirilebilir. Son olarak, farklı akış sitometreleri kullanılarak numunelerin analiz edilebildiği hücre içi veya hücre dışı protein için boyama da yapılabilir. Hücre içi sitokin ve CD107a boyama için (aynı anda değerlendirilebilen adım 3.4), sinyalleri en üst düzeye çıkarmak için monensin ve/veya brefeldin A eklenmelidir. Her deneysel hedef için farklı platformlar kullandık ve hala benzer sonuçlar gözlemledik. Bu nedenle, yöntem çalışmaya bağlı olarak çeşitli reaktifler, platformlar ve aletlerle tamamlanabilir.
Stimülasyon için çapraz bağlama süresi çalışmanın amacına bağlı olacaktır. Sinyal çalışmaları isteniyorsa, tipik çapraz bağlama stimülasyon süresi 2 dk ile 10 dk arasındadır pAKT, pPRAS40 ve pERK1/2 birikimi 2 dakikada zirveler ve 10 dk8,9'dansonra kaybolur. Fonksiyonel çalışmalar için (yani kemokin/ sitokin üretimi içerenler), hücreler analit9'abağlı olarak en az 30 dakika uyarılmalıdır. Gen ekspresyon analizi de tipik olarak 30 dk stimülasyon gerektirir9. RANTES gen ekspresyonunu okuma olarak kullanırken dikkatli olunmalıdır, çünkü RANTES mRNA üretimi transkripsiyonal aktivasyondan bağımsızdır, çünkü stimülasyon üzerine proteinin hızlı çevirisi ve salınımı için hücrelerde zaten saklanır25. Degranülasyon, aksine, en az 3 saat stimülasyon gerektirir. Bu genel gözlemlere rağmen, araştırmacılar belirli ilgi molekülleri için en uygun stimülasyon süresini belirlemek için kinetik çalışmalar yapmalıdır.
Benzer şekilde, araştırmacılar optimal konsantrasyonu belirlemek için ilgi antikoru titratmalıdır, çünkü farklı özelliklere sahip antikorlar, aynı izotipte olsalar bile, farklı yakınlıklara sahip FcφRIIIa'ya bağlanırlar. Örneğin, rituximab ve trastuzumab her ikisi de bir IgG1 izotipidir, ancak trastuzumab, FcφRIIIa'nın valine polimorfizmine rituksimab26,27'dendaha güçlü bağlanır. Benzeşimdeki bu fark, yayınlanan çalışmalarda gözlemlendiği gibi degranülasyon gibi fonksiyonel farklılıklara yol açabilir8.
Antikorun Fc kısmının FcφRIIIa için sahip olduğu düşük benzeşim nedeniyle optimal konsantrasyonun belirlenmesi de önemlidir. Bu, antikorun Fc reseptörüne bağlanmasından sonra yıkama adımlarını içerdiğinden antikorun yıkanmasıyla sonuçlanabilir. Bu daha sonra stimülasyondan sonra CD107a pozitif hücrelerin düşük yüzdesi tarafından önerildikçe tahlillerde hassasiyet eksikliğine yol açabilir (Şekil 5). Bununla birlikte, en uygun konsantrasyonun belirlenmesi, sonuçların hassasiyet eksikliğinden kaynaklanmaması konusunda güven sağlamalıdır. Ek olarak, hücreler tek hücre okumalarının aksine toplu hücre kullanan biyokimyasal ve fonksiyonel tahlillerde açıkça aktive edilir (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 6).
Protokol, fizyolojik olarak meydana gelenleri tamamen taklit etmediği için de sınırlıdır. Kullanılan ikincil anti-insan K antikoru, hücreler üzerinde ifade edilen hedef antijen tarafından oluşturulan çapraz bağlamayı taklit etmektir. Burada, maksimum yanıtı oluşturmak için doygun miktarda ikincil antikor eklenir. Bununla birlikte, farklı hedef hücreler, çapraz bağlama ve tepkiyi etkileyecek farklı antijen seviyelerini ifade edecektir. Şu anda, bu platform farklı antijen ifade seviyelerinin etkilerini taklit etmek için optimize değildir.
Bu deneyleri yaparken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer faktör de bireyler arasındaki farklı genetik geçmişler ve immünolojik geçmişler nedeniyle donörden donöre değişkenliktir. Bu nedenle, aynı tahlillerde farklı donörlerden gelen NK hücre yanıtları karşılaştırılırken dikkatli olunmalıdır. Benzer şekilde, farklı donörler kullanıldığında sadece genel sonuçlar çıkarılmalıdır.
Tamamen, açıklanan yöntem, NK hücrelerindeki antikor tahrikli FcφRIIIa aracılı olayları incelemek için basit ve esnek bir stimülasyon platformudur. Afukosillenmiş antikorlarla gözlenen artan ADCC ve etkinliğin temelini daha iyi anlamak için kullanılmıştır8. Bu yöntem ayrıca terapötik antikorlar ve PI3K küçük molekül inhibitörlerini birleştiren bir çalışmada da kullanıldı9. Ek olarak, pS6 tarafından düzenlenen kemokin ve sitokin üretimi için daha önce bilinmeyen bir mekanizma tespit edildi9. Bu nedenle, bu yapay sinyal platformunu kullanan gelecekteki çalışmalar, FcφRIIIa tarafından yönlendirilen efektör işlevleri için düzenleme mekanizmalarını daha da aydınlatabilir. Ayrıca, bu mekanizmalar için önemli olan yeni molekülleri ve bilinen moleküller için yeni rolleri de tanımlayabilir.
Disclosures
Tüm yazarlar iQ Biosciences için çalışan veya danışmandır.
Acknowledgments
Yazarlar James Lee ve Christopher Ng'ye bu makalenin yorumları ve editörlüğü için teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
| B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
| CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
| Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
| FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
| Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
| IFN-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
| Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
| MIP-1? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
| MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
| NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
| PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
| RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
| RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
| RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| TNF-? primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
| Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
| β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |
References
- Hudis, C. A. Trastuzumab - Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. New England Journal of Medicine. 357 (1), 39-51 (2007).
- Weiner, G. J.
- Orange, J. S. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 8 (9), 713-725 (2008).
- Bonnema, J. D., Karnitz, L. M., Schoon, R. A., Abraham, R. T., Leibson, P. J. Fc receptor stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase in natural killer cells is associated with protein kinase C-independent granule release and cell-mediated cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1427-1435 (1994).
- Jiang, K., et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nature Immunology. 1 (5), 419-425 (2000).
- Kanakaraj, P., et al. Phosphatidylinositol-3 kinase activation induced upon Fc gamma RIIIA-ligand interaction. The Journal of Experimental Medicine. 179 (2), 551-558 (1994).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Liu, S. D., et al. Afucosylated Antibodies Increase Activation of FcγRIIIa-Dependent Signaling Components to Intensify Processes Promoting ADCC. Cancer Immunology Research. 3 (2), 173-183 (2015).
- Romeo, V., Gierke, S., Edgar, K. A., Liu, S. D. Effects of PI3K Inhibition on Afucosylated Antibody-Driven FcγRIIIa Events and Phospho-S6 Activity in NK Cells. The Journal of Immunology. 203 (1), 137-147 (2019).
- Mössner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Shields, R. L., et al. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. The Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Junttila, T. T., et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4481-4489 (2010).
- Goede, V., et al. Obinutuzumab (GA101) plus chlorambucil (Clb) or rituximab (R) plus Clb versus Clb alone in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and preexisting medical conditions (comorbidities): Final stage 1 results of the CLL11 (BO21004) phase III trial. Journal of Clinical Oncology. 31, 15_suppl 7004 (2013).
- Sehn, L. H., et al. Randomized Phase II Trial Comparing Obinutuzumab (GA101) With Rituximab in Patients with Relapsed CD20+ Indolent B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Final Analysis of the GAUSS Study. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3467-3474 (2015).
- Pons-Tostivint, E., Thibault, B., Guillermet-Guibert, J. Targeting PI3K Signaling in Combination Cancer Therapy. Trends in Cancer. 3 (6), 454-469 (2017).
- Engelman, J. A. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nature Reviews. Cancer. 9 (8), 550-562 (2009).
- Fruman, D. A., Rommel, C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (2), 140-156 (2014).
- Janku, F., Yap, T. A., Meric-Bernstam, F. Targeting the PI3K pathway in cancer: are we making headway. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (5), 273-291 (2018).
- Samuels, Y., et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 304 (5670), New York, N.Y. 554 (2004).
- Kanevskiy, L. M., Telford, W. G., Sapozhnikov, A. M., Kovalenko, E. I. Lipopolysaccharide induces IFN-γ production in human NK cells. Frontiers in Immunology. 4, (2013).
- Romagnani, C., et al. Activation of human NK cells by plasmacytoid dendritic cells and its modulation by CD4+ T helper cells and CD4+ CD25hi T regulatory cells. European Journal of Immunology. 35 (8), 2452-2458 (2005).
- Sivori, S., et al. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: Induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10116-10121 (2004).
- Hanna, J., et al. Novel Insights on Human NK Cells' Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. The Journal of Immunology. 173 (11), 6547-6563 (2004).
- Swanson, B. J., Murakami, M., Mitchell, T. C., Kappler, J., Marrack, P. RANTES production by memory phenotype T cells is controlled by a posttranscriptional, TCR-dependent process. Immunity. 17 (5), 605-615 (2002).
- Jo, M., Kwon, H. S., Lee, K. H., Lee, J. C., Jung, S. T. Engineered aglycosylated full-length IgG Fc variants exhibiting improved FcγRIIIa binding and tumor cell clearance. mAbs. 10 (2), 278-289 (2018).
- Isoda, Y., et al. Importance of the Side Chain at Position 296 of Antibody Fc in Interactions with FcγRIIIa and Other Fcγ Receptors. PLoS ONE. 10 (10), 0140120 (2015).
