Vurdering af humane naturlige killer celle begivenheder drevet af FcγRIIIa Engagement i nærvær af terapeutiske antistoffer

Summary

En protokol til undersøgelse af FcγRIIIa-drevne hændelser af terapeutiske antistoffer i menneskelige naturlige dræberceller er beskrevet her. Denne kunstige stimuleringsplatform gør det muligt at forhøre downstream-effektorfunktioner som degranulation, chemokin/cytokinproduktion og signalveje, der medieres af De Europæiske Forbindelser og Fc,som er forbundet med binding.

Abstract

En virkningsmekanisme for klinisk effekt ved terapeutiske antistoffer er fremme af immunrelaterede funktioner, såsom cytokin sekretion og cytotoksicitet, drevet af FcγRIIIa (CD16) udtrykt på naturlige dræber (NK) celler. Disse observationer har ført til forskning med fokus på metoder til at øge Fc receptor-medieret begivenheder, som omfatter fjernelse af en fucose moiety fundet på Fc del af antistoffet. Yderligere undersøgelser har belyst de mekanistiske ændringer i signalering, cellulære processer og cytotoksiske egenskaber, der øger ADCC-aktiviteten med afucosylerede antistoffer. Derudover har andre undersøgelser vist de potentielle fordele ved disse antistoffer i kombination med små molekylehæmmere. Disse eksperimenter demonstrerede de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for fordelene ved at bruge afucosylerede antistoffer i kombinationsindstillinger. Mange af disse observationer var baseret på en kunstig in vitro aktivering assay, hvor FcγRIIIa på humane NK celler blev aktiveret af terapeutiske antistoffer. Denne analyse gav fleksibilitet til at studere downstream effektor NK celle funktioner, såsom cytokin produktion og degranulation. Derudover er denne analyse blevet brugt til at afhøre signalveje og identificere molekyler, der kan moduleres eller bruges som biomarkører. Endelig er andre terapeutiske molekyler (dvs. små molekylehæmmere) blevet tilføjet til systemet for at give indsigt i kombinationen af disse terapeutiske lægemidler med terapeutiske antistoffer, hvilket er afgørende i det nuværende kliniske rum. Dette manuskript har til formål at give et teknisk grundlag for at udføre denne kunstige menneskelige NK celle aktivering assay. Protokollen demonstrerer vigtige trin for celleaktivering samt potentielle downstream-applikationer, der spænder fra funktionelle udlæsninger til mere mekanistiske observationer.

Introduction

I løbet af de sidste par årtier har der været enormt fokus på at udvikle målrettede kræftbehandlinger ved hjælp af antistoffer. Terapeutiske antistoffer, såsom trastuzumab og rituximab, opererer gennem flere mekanismer, herunder forebyggelse af dimerisering af signalmolekyler og mobilisering af immunsystemet^1,2. Sidstnævnte opnås gennem antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC), hvor lymfocytter kaldet naturlige dræberceller (NK) bringes til en målcelle af antistoffet^1,2. Ved at placere cellerne i nærheden af hinanden aktiveres NK-cellen og kan lyse en tumor / målcelle gennem udskillelsen af effektormolekyler³.

På molekylært niveau binder Fab-delen af antistoffet sit cognate antigen udtrykt på tumorcellerne, mens dets Fc-del engagerer FcγRIIIa udtrykt på NK-celler for at bringe de to celler sammen^1,2. Efter engagement af FcγRIIIa, signalering veje (dvs. MAPK og PI3K veje) drev cytoskeletal omlægning, cytokin produktion, og cytotoksicitet^4,5,6,7,8,9. Således er ADCC en FcγRIIIa-drevet begivenhed medieret af NK-celler og antistoffer.

Fordi ADCC blev anset for at være en virkningsmekanisme for disse terapeutiske antistoffer, forskere søgte efter metoder til at øge ADCC ved at ændre antistoffet. En ændring var fjernelsen af fucose på oligosaccharid kæde knyttet til asparagine 297, hvilket øger den bindende affinitet af Fc del af antistoffet til FcγRIIIa^10,11,12. I dyreforsøg udviste mus, der fik afukosylerede antistoffer, langsommere tumorvækst sammenlignet med mus, der blev behandlet med dets fucosylerede modstykke¹³. Endnu vigtigere, obinutuzumab (f.eks Gazyva, en godkendt afucosyleret antistof) viste bedre effekt i forhold til rituximab (f.eks Rituxan, dens fucosylated modstykke) hos patienter diagnosticeret med kronisk lymfocytisk leukæmi eller follikulær lymfom^14,15.

Indtil for nylig var de mekanismer, der lå til grund for øget ADCC via afucosylerede antistoffer, ukendte. Kombineret med det faktum, at der er mange forskningsprogrammer, der udvikler terapeutiske antistoffer til at udnytte FcγRIIIa-drevne mekanismer til at målrette kræftceller, er det bydende nødvendigt at udvikle in vitro-analyser, der undersøger de molekylære og cellulære aspekter, der fremmes af disse antistoffer. Dette giver grundlæggende forståelse af virkningsmekanismerne samt potentialet til at opdage biomarkører. Som sådan blev der udviklet en kunstig aktiveringsanalyse til undersøgelse af antistofafhængige FcγRIIIa-medierede funktioner ud over signalerings- og cellulære egenskaber⁸. Gennem disse undersøgelser er de mekanismer, der ligger til grund for øget effekt af afucosylerede antistoffer, blevet belyst, hvor øget bindende affinitet øger signalerne for at fremme cellulære egenskaber og cytotoksiske egenskaber⁸.

Den nuværende tendens i kliniske forsøg er brug af en kombination af terapeutiske molekyler¹⁶. En af de mest almindeligt muterede veje er PI3K-stien, som har gjort en enorm indsats for at udvikle små molekylehæmmere, der er målrettet komponenter i denne vej^17,18,19,20. Men hvordan disse molekyler virker i kombination med terapeutiske antistoffer er relativt ukendt, især i kombinationer, hvor hæmmeren kan påvirke molekyler, der kræver PI3K-vejen for at fungere, såsom dem, der drives af terapeutiske antistoffer.

Med henblik herpå er in vitro-analysen, der anvendes til de afucosylerede antistofundersøgelser, også blevet anvendt til at studere kombinationen af PI3K-hæmmere og terapeutiske antistoffer. Disse undersøgelser definerede de molekylære egenskaber ved PI3K-hæmning på terapeutiske antistof-PI3K-drevne hændelser og beskrev, hvordan afucosylerede antistoffer kan opveje dette tab af signalering⁹. Disse resultater er relevante, da de giver potentiel vejledning til design af kliniske forsøg. Derudover førte denne serie af eksperimenter også til de første beskrevne observationer til kinetisk regulering af PI3K-signalvejen til modulering af chemokin /cytokintransskription og produktion, som kan tjene som potentielle biomarkører⁹.

Den kunstige in vitro-aktiveringsanalyse, der anvendes til at definere de signal- og cellulære egenskaber, der er beskrevet ovenfor, er designet til at studere FcγRIIIa-drevne hændelser i NK-celler medieret af antistoffer i mangel af målceller. Uden målceller i systemet kan alle de observerede signalhændelser og funktioner henføres direkte til NK-cellerne. I den præsenterede analyse tilsættes antistof til rensede NK-celler, hvorefter Fc-delen binder FcγRIIIa. Dette efterfølges af krydslinking af antistoffet ved hjælp af et anti-humant κ lyskædeantistof til kunstigt at stimulere cellerne. Krydslinking af antistoffet efterligner binding af målantigen for at generere en signalplatform, der fremkalder downstream-hændelser. Afhængigt af stimuleringens længde kan forskere vurdere signalering, cellulære processer, cytotoksiske egenskaber og effektorfunktioner^8,9. Tilsvarende giver denne analyse også fleksibilitet i studiet af disse hændelser, når antistoffer kombineres med andre molekyler⁹.

Sammen er dette en ideel in vitro-analyse til at studere terapeutiske antistoffer, der fremkalder NK-cellerespons gennem deres FcγRIIIa som en del af virkningsmekanismen. Denne protokol beskriver udførelsen af denne in vitro aktivering assay og giver indsigt i de forskellige udlæsninger, der kan udføres.

Protocol

Følgende protokol er i overensstemmelse med retningslinjerne fra iQ Biosciences etiske komité for human forskning. 1. Isolering af PBMCs og berigelse/rensning af NK-celler BEMÆRK: Andre metoder til isolering af perifere blodmonnukleare celler (PBMCs) og berigelse / rensning kan også udføres. Træk 200 mL blod under regulerede forhold i et rør, der indeholder heparin. Tilsættes 15 mL af tætheden gradient medium i en 50 mL rør med en porøs barriere indarbejdet. Drej røret ved 1000 x g i 30 s. Tilsæt 12,5 mL blod i røret efterfulgt af yderligere 12,5 mL PBS, og vend forsigtigt 3x. Drej røret ved 800 x g i 15 min ved stuetemperatur (RT) uden pauser. Forbered et 50 mL konisk rør med 40 mL PBS til hvert rør med en porøs barriere, mens cellerne spinder. Fjern forsigtigt rørene og undersøg forsigtigt efter centrifugering. Kontroller, om der er et tyndt, synligt hvidt lag af PBMCs over den porøse barriere mellem 20 mL og 25 mL afgrænsningerne på 50 mL-røret. Fjern forsigtigt så meget væske som muligt fra toppen ved hjælp af en pipette uden at forstyrre det tynde, hvide PBMC-lag. Med en ren 10 mL serologisk pipette skal du forsigtigt fjerne PBMC-laget ud over det klare, gullige væskelag ned til rørets filter. Udvis pIC’erne og væsken ud i den 50 mL koniske, indeholdende PBS, der er fremstillet i trin 1.4. Spinrør på RT og 300 x g i 5 min. Aspirer PBS vask og tilsæt yderligere 40 mL PBS. Spinrør på RT og 300 x g i 5 min. Efter vask tælles cellerne og genanvendes i 40 μL på 2% BSA/PBS pr. 1 x 107 celler. Fortsæt til isolering af NK-celler ved hjælp af den valgte metode. Valgmulighederne omfatter manuel eller automatiseret magnetisk perlebaseret sortering9,21. Fluorescensaktiveret cellesortering kan også udføres22. Fjern en lille aliquot af celler for at bestemme renheden af NK-celler ved flowcytometri. Gating strategi omfatter følgende: gate på levende celler baseret på fremad vs side scatter profil, derefter vurdere renheden baseret på NK markører (f.eks CD3, CD56) i den specifikke levende befolkning. Typisk renhed er >95%. Når isolationen er afsluttet, spinceller ved RT og 300 x g i 5 min til pellet og aspirere. Brug cellepillen til 1 x 107 celler/mL i RPMI 1640 med næringsstoffer, 10% varmeinaktiveret FBS, 1 mM natrium pyruvat, 55 mM 2-ME og 10 mM HEPES (pH = 7,2). 2. Antistofmedieret aktivering af NK-celler via FcγRIIIa Sæt en nedkølet mikrocentrifuge til 4 °C. Dispenser 1 x 106 (100 μL) suspenderede NK-celler i 1,5 mL rør og placeres på is.BEMÆRK: Celler kan dispenseres i en 96 godt U-bundplade, hvis der er mange prøver. Der fremstilles 1 μL på 100 μg/mL rituximab (eller interessestof) pr. prøve, og der tilsættes 1 μL til cellerne med henblik på en endelig koncentration på 1 μg/mL antistof.BEMÆRK: Andre molekyler kan tilsættes til cellerne på dette tidspunkt eller tidligere til vurdering af kombinationseffekter. Her blev ritixumab brugt til stimulering. I tidligere undersøgelser er små molekylehæmmere blevet tilføjet til stimuleringer9. Inkuber prøven på is i 30 min. Under inkubationen forberedes 50 μL på 50 μg/mL anti-human κ lyskædeantistof pr. prøve i medier og opvarmes til 37 °C på en varmeblok eller i et vandbad. Efter inkubation af celler på is tilsættes 1 mL iskolde medier og spinder ved 135 x g i 5 min ved 4 °C. Vask igen med 1 mL iskolde medier. Supernatanten aspirer efter den sidste vask og tilsættes 50 μL af den anti-humane κ lyskædeblanding, der er fremstillet i trin 2.5. Straks inkuberes prøver for slutbrugeren bestemte tidspunkter ved 37 °C på en varmeblok eller i et vandbad. Stop stimuleringen ved at tilsætte 1 mL iskolde medier og drej straks prøver i en nedkølet centrifuge ved 135 x g i 5 min. Vask igen med 1 mL iskolde medier. 3. Downstream-applikationer og udlæsninger Forhør af signalmolekyler i FcγRIIIa-stimulerede NK-celler ved western blot-analyseBEMÆRK: Der kan anvendes forskellige proteinadskillelses- og membranoverførselsapparater. Efter den sidste vask med iskolde medier (trin 2.8) blandes lyseceller med 20 μL RIPA-buffer, der indeholder fosfatase- og proteasehæmmere, i 30 min på is. Spinrør ved 2100 x g i 15 min ved 4 °C. Lysatet overføres til et rent 1,5 mL rør, og de reagenser, der er nødvendige for proteinadskillelse, til et rent 1,5 ML rør. Adskil proteiner på SDS-PAGE gel og overfør til en nitrocellulose eller PVDF membran efter standardprotokoller. Bloker og sonde membranen i henhold til fabrikantens dataark for det primære detektionsantistof (her blev der anvendt pAKT, pPRAS 40 og pERK1/2). Tilsættes HRP konjugeret sekundært antistof og chemiluminescens reagens pr producentens anbefalinger på PVDF membran. Brug røntgenfilm eller detektionsinstrument til at visualisere (her blev pAKT detekteret ved 60 kDa, pPRAS40 ved 40 kDa og pERK1/2 ved 42 kDa og 44 kDa). Isolering af mRNA og forberedelse til genekspressionsanalyse af FcγRIIIa-stimulerede NK-celler (Materialetabel) Når stimuleringstidspunktet er nået (trin 2.7), skal røret placeres på is og straks dreje i en nedkølet centrifuge ved 135 x g i 5 min (svarende til trin 2.8). Fjern supernatanten, og vask 2x med 1 mL iskold PBS. Lyse celler ved hjælp af guanidium isothiocyanate RNA ekstraktion (Tabel af materialer). Brug 1 μg mRNA til at udføre omvendt transskription ved hjælp af tilfældige hexamerer med et kommercielt sæt (Materialetabel).BEMÆRK: Enhver metode til RNA-ekstraktion eller cDNA-syntese kan anvendes9,23,24. Frys cDNA ved -20 °C indtil genekspressionsanalyse. Cytoskeletal rearrangement vurdering i FcγRIIIa-stimuleret NK celler Efter den sidste vask med iskolde medier (trin 2.8) genbruges cellepillen med 50 μL på 3,7% paraformaldehyd i 10 min ved RT. Tilsæt 1 mL PBS og spin ved 135 x g i 5 min på RT. Gentag denne vask igen. Tilsæt 100 μL på 0,1% Triton X-100/PBS i 5 min til permeabilize celler, og spin celler på 135 x g i 5 min på RT til pellet. Der tilsættes 100 μL 5 enheder/mL AF488-mærket phalloidin fortyndet i 1% BSA/PBS og inkuberes i 20 min på RT. Tilsæt 1 mL PBS og spin ved 135 x g i 5 min på RT for at vaske. Resuspend celle pellet i den ønskede volumen for flow cytometrisk analyse. Vurdering af degranulation af FcγRIIIa-stimulerede NK-celler ved hjælp af CD107a overfladefarvning Inkuberer cellerne med antistoffet af interesse på is som beskrevet i trin 2.1-2.4. Under inkubationen fremstilles 50 μL antistofblandinger pr. prøve. Blandingen forberedes i cellemedier med en endelig koncentration på 50 μg/mL anti-human κ lyskædeantistof og 1 μg/mL fluorochrome-mærket CD107a. Efter inkubation af cellerne på is tilsættes 1 mL iskolde medier. Drej ved 135 x g i 5 min ved 4 °C, og vask derefter igen med 1 mL iskolde medier. Supernatanten aspirerer efter den sidste vask, tilsæt derefter 50 μL af den anti-humane κ lyskædeblanding og inkuberes ved 37 °C for de ønskede tidspunkter. Ved de ønskede tidsintervaller tilsættes 1 mL PBS og spin ved 135 x g i 5 min ved RT. Aspirate supernatant og tilsæt 100 μL på 4% paraformaldehyd. Inkuber på RT i 10 min. Tilsæt 1 mL PBS og spin ved 135 x g i 5 min på RT for at vaske. Resuspend celle pellet i den ønskede volumen for flow cytometrisk analyse. Vurdering af chemokin/cytokinproduktion fra FcγRIIIa-stimulerede NK-cellerBEMÆRK: Der kan anvendes forskellige metoder og/eller kits til vurdering af chemokin- og cytokinproduktion. Når stimuleringstidspunktet er nået (trin 2.7), skal røret straks placeres på is og dreje i en nedkølet centrifuge ved 135 x g i 5 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et rent fartøj. Frys supernatanten indtil chemokin eller cytokinvurdering ved hjælp af den ønskede analyse.BEMÆRK: Cellepiller kan nu vaskes med iskold PBS og behandles til signalering, genekspression og cytoskeletal omlejringsundersøgelser.

Representative Results

Det er vigtigt, at NK celle renhed er høj, fordi Fc del af antistoffer kan binde FcγRIIIa udtrykt på andre celletyper, såsom monocytter. Med høj renhed kan de fremsatte observationer henføres direkte til FcγRIIIa-drevne hændelser i NK-celler. Her havde NK-celler større renhed end 90 % baseret på CD56- og CD3-pletter (figur 1). Desuden var rentabiliteten > 95%. Pleje bør anvendes ved brug af isolationer med lavere levedygtighed. For at sikre, at hændelserne blev drevet af FcγRIIIa, blev der udført vestlige pletter for fosfo-AKT (pAKT), fosfo-PRAS40 (pPRAS40) og fosfo-ERK1/2 (pERK1/2), hvor NK-celler blev aktiveret i 1-5 min. Som vist blev der observeret en ophobning af disse molekyler (Figur 2). Tilsvarende aktiverede NK-celler udtrykt MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ, og TNF-α, som det fremgår af genekspression analyse (Figur 3). Derudover blev cytoskeletal omlejring observeret i aktiverede celler (Figur 4). En procentdel af NK-celler stimuleret i 4 timer udtrykt CD107a på celleoverfladen (Figur 5). Derudover blev IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β og RANTES påvist i supernatanten efter 3 timers stimulering (Figur 6). Disse udlæsninger forventes baseret på offentliggjorte undersøgelser som aktiverede NK celler vil have disse fosforylerede proteiner, samt genekspression og produktion af de nævnte chemokiner og cytokiner8,9. I alle forsøg bør stimuleringsbetingelserne omfatte en anti-human κ lyskæde kun kontrol og antistof uden anti-human κ lys crosslinking kontrol. Disse NK-celler bør ikke udvise fosfosignalering, degranulation, chemokin/cytokinproduktion eller chemokin/cytokingenekspression. Figur 1: Repræsentative flowprofiler af NK-cellerenhed efter isolering fra PBMCs. PBMCs blev isoleret fra blod fra en sund donor, efterfulgt af berigelse af NK-celler ved hjælp af en negativ udvælgelsesmetode for human NK celleisolering (Materialetabel). Celler blev farves med CD56 og CD3 før og efter berigelse for at bestemme renhed. Repræsentative prikplotter af CD56 vs. CD3 før og efter isolation. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: FcγRIIIa-aktiverede NK-celler udviser fosforylerede signalmolekyler. Celler blev stimuleret med rituximab i 2 min, og celle lysater blev lavet i henhold til protokollen. Lysater blev adskilt på en 4%-12% gel, efterfulgt af overførsel til en PVDF membran. Membranen blev undersøgt med antistoffer mod pAKT, pPRAS40, pERK1/2 og actin. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: FcγRIIIa-aktiverede NK-celler udtrykker chemokin og cytokingener. NK-celler blev stimuleret med rituximab i 0 h, 0,5 h, og 1 h. mRNA blev indsamlet, omvendt transskriberet og underkastet qPCR-analyse for MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ og TNF-α (Materialetabel). (A) Relativt udtryk for MIP-1α, MIP-1β og RANTES på hvert tidspunkt. (B) Relative udtryk for IFN-γ og TNF-α på hvert tidspunkt. Værdier blev normaliseret til actin genet. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: FcγRIIIa-aktiverede NK-celler udviser cytoskeletal omlejring. NK-celler blev stimuleret med rituximab i 0 min, 5 min, 15 min og 30 min, efterfulgt af vurdering for cytoskeletal omlægning af phalloidin farvning og flow cytometri. Forholdet mellem MFI på eksperimentelt tidspunkt og MFI på tid 0 af NK-celler stimuleret med rituximab (cirkel, fast linje) eller sekundært antistof alene (firkantet, prikket linje). Søjler repræsenterer SD af fire replikter. Stjerner repræsenterer statistisk signifikans baseret på en to-tailed uparret Student’s t-test (* p < 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 5: FcγRIIIa-aktiverede NK-celler udtrykker CD107a. NK-celler blev stimuleret med rituximab i 4 timer efterfulgt af vurdering for degranulation af CD107a og flowcytometri. (A) Procentdel af NK-celler, der udtrykker CD107a efter stimulering med rituximab (hvide stænger) eller anti-humant κ lyskædeantistof (grå bjælker) i 0 timer og 4 timer. (B) CD107a MFI af NK-celler stimuleret med rituximab (hvide stænger) eller anti-humant κ lyskædeantistof (grå bjælker) efter 0 h og 4 timers behandling. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 6: FcγRIIIa-aktiverede NK-celler udskiller chemokiner og cytokiner. NK-celler blev stimuleret i 0, 0,5, 1, 3 og 6 timer med rituximab. Supernatant blev indsamlet til måling af frigivelse af MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ, og TNF-α ved en flow- og perle-baseret cytokin vurderingsmetode (Tabel over materialer). A) MIP-1α, MIP-1β og RANTES-produktion på hvert tidspunkt. (B) IFN-γ og TNF-α produktionen på hvert tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver metoder til undersøgelse af FcγRIIIa-drevne hændelser i NK-celler medieret af antistoffer. Disse teknikker gør det muligt at vurdere potentielle virkningsmekanismer for terapeutiske antistoffer, som foreslås at være ADCC^1,2. Specifikt giver disse metoder fleksibilitet i studiet af underliggende molekylære signalveje og cellulære processer, der er ansvarlige for ADCC. De tillader også observation af andre effektorfunktioner, såsom chemokin og cytokinproduktion. Derudover gør disse metoder det muligt at identificere potentielle biomarkører og molekyler, der kan målrettes mod at modulere ADCC.

Grundlaget for denne protokol er den kunstige stimulering af NK-celler gennem FcγRIIIa med antistoffer i mangel af målceller. Antistofbundne målceller tjener typisk til at fremme krydskædningen af Fc-receptorer for at danne en platform, der driver signalering og downstream-effekter. I stedet, crosslinking opnås ved hjælp af en anti-human κ lyskæde antistof i denne analyse, uden om behovet for målceller til at stimulere NK celler. Uden målceller kan resultaterne og observationerne tilskrives direkte NK-cellerne, forudsat at rensningsprocessen er vellykket.

Det er vigtigt, at ved hjælp af anti-human κ lyskæde antistof til at krydse antistoffet ikke forstyrrer den bindende affinitet af Fc del for FcγRIIIa, en interaktion, der dikterer styrken af respons^10,11,12,13. Undersøgelser har faktisk vist, at afucosylerede antistoffer øger ADCC på grund af deres øgede affinitet for FcγRIIIa^10,11,12,13. Efterfølgende undersøgelser viste, at denne øgede affinitet ikke påvirkes af anti-human κ light chain sekundær antistoferstatning og kan bruges til at studere grundlaget for øget ADCC⁸. For at sikre, at NK-cellen stimuleres gennem krydslinking af antistoffet, bør der kun medtages to negative kontroller: 1) kun terapeutisk antistof uden det sekundære anti-humane κ lyskædeantistof og 2) kun det sekundære anti-humane κ light chain antistof. I begge tilfælde bør der ikke genereres nogen signal- eller effektorfunktion.

Denne metode giver også fleksibilitet til at studere virkningerne af terapeutiske antistoffer på små molekylehæmmere. Hæmmeren kan tilsættes, før den krydser med det sekundære antistof, så hæmmeren har tid til at engagere sit mål. Der bør dog udføres undersøgelser for at bestemme den optimale tid for forbehandling af hæmmeren; således har hæmmeren en maksimal effekt på stimuleringen. Med det sagt, forskere kan også vælge at studere virkningerne af en hæmmer efter stimulering. I dette tilfælde kan hæmmeren tilføjes efter crosslinking for at studere, hvordan det påvirker signaler og processer, der allerede er genereret. Sammen giver den metode, der er beskrevet her, maksimal fleksibilitet i studiet af kombinatoriske virkninger af forskellige småmolekylehæmmere med terapeutiske antistoffer.

Som nævnt ovenfor kan en række udlæsninger udføres efter stimulering. Vestlig blotting kan udføres for at studere signalering ved hjælp af SDS-PAGE og membranoverførselssystemer fra forskellige leverandører. På samme måde kan genekspression også vurderes ved hjælp af forskellige RNA-ekstraktionsmetoder, omvendte transskriptionsreagenser og genekspressionsinstrumenter. Endelig kan farvning for intracellulært eller ekstracellulært protein også udføres, hvor prøver kan analyseres ved hjælp af forskellige flowcytometre. For intracellulær cytokin og CD107a farvning (trin 3.4, som kan vurderes samtidigt), skal der tilføjes monensin og/eller brefeldin A for at maksimere signalerne. Vi har brugt forskellige platforme til hvert eksperimentelt mål og observerede stadig lignende resultater. Derfor kan metoden suppleres med forskellige reagenser, platforme og instrumenter, afhængigt af undersøgelsen.

Den tværgående tid til stimulering vil afhænge af målet med undersøgelsen. Hvis der ønskes signalstudier, er den typiske stimuleringstid på tværs af 2 min. og 10 min. pAKT, pPRAS40 og pERK1/2 akkumulering topper ved 2 min og forsvinder efter 10^{min. 8,9}. For funktionelle undersøgelser (dvs. dem, der involverer chemokin /cytokinproduktion), skal cellerne stimuleres i mindst 30 min, afhængigt af analysanden⁹. Genekspression analyse kræver også typisk 30 min stimulation⁹. Forsigtighed bør udvises, når der anvendes RANTES-genekspression som udlæsning, da RANTES mRNA-produktionen er uafhængig af transskriptionsaktivering, da den allerede er lagret i celler til hurtig oversættelse og frigivelse af protein ved stimulering²⁵. Degranulation, derimod, kræver mindst 3 timers stimulering. På trods af disse generelle observationer bør forskere udføre kinetiske undersøgelser for at bestemme den optimale stimuleringstid for de særlige molekyler af interesse.

På samme måde bør forskerne titrere antistoffet af interesse for at bestemme den optimale koncentration, fordi antistoffer med forskellige specificiteter binder sig til FcγRIIIa med forskellige tilhørsforhold, selvom de er af samme isotype. For eksempel er rituximab og trastuzumab begge en IgG1 isotype, men trastuzumab binder sig stærkere til valinepolymorfien i FcγRIIIa end rituximab^26,27. Denne forskel i affinitet kan føre til funktionelle forskelle, såsom degranulation, som observeret i offentliggjorte undersøgelser⁸.

Bestemmelse af den optimale koncentration er også vigtigt på grund af den lave affinitet Fc del af antistoffet har for FcγRIIIa. Dette kan resultere i afvask af antistoffet, da protokollen omfatter vasketrin efter binding af antistoffet til Fc-receptoren. Dette kan derefter føre til manglende følsomhed i analyserne som foreslået af den lave procentdel af CD107a positive celler efter stimulering (Figur 5). Fastsættelsen af den optimale koncentration bør dog give tillid til, at resultaterne ikke skyldes manglende følsomhed. Desuden aktiveres cellerne tydeligt i de biokemiske og funktionelle analyser, der anvender bulkcelle i modsætning til enkeltcelleudlæsninger (Figur 2, Figur 3, Figur 6).

Protokollen er også begrænset, da den ikke helt efterligner, hvad der sker fysiologisk. Den sekundære anti-humane K antistof anvendes er at efterligne crosslinking genereret af mål antigen udtrykt på celler. Her tilsættes en mættende mængde sekundært antistof for at generere det maksimale respons. Men, særskilte målceller vil udtrykke forskellige niveauer af antigen, som vil påvirke crosslinking og respons. I øjeblikket er denne platform ikke optimeret til at efterligne virkningerne af forskellige antigenudtryksniveauer.

En anden faktor at overveje, når de udfører disse eksperimenter er donor-til-donor variabilitet på grund af forskellige genetiske baggrunde og immunologiske historier blandt enkeltpersoner. Derfor skal man være forsigtig, når man sammenligner NK celle svar fra forskellige donorer på tværs af de samme analyser. På samme måde bør der kun drages generelle konklusioner, når der anvendes forskellige donorer.

Alt i alt er den beskrevne metode en enkel og fleksibel stimuleringsplatform til at studere antistofdrevne FcγRIIIa-medierede hændelser i NK-celler. Det er blevet brugt til bedre at forstå grundlaget for den øgede ADCC og effekt observeret med afucosylerede antistoffer⁸. Denne metode blev også anvendt i en undersøgelse, der kombinerer terapeutiske antistoffer og PI3K små molekylehæmmere⁹. Derudover blev en hidtil ukendt mekanisme til chemokin- og cytokinproduktion reguleret af pS6 identificeret⁹. Derfor kan fremtidige undersøgelser ved hjælp af denne kunstige signalplatform yderligere belyse reguleringsmekanismer for effektorfunktioner drevet af FcγRIIIa. Det kan også potentielt identificere nye molekyler, der er vigtige for disse mekanismer samt nye roller for kendte molekyler.

Materials

16% paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	50-980-487
Alexa Fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
anti-mouse HRP antibody	Cell Signaling Technologies	7076
AutoMACS instrument	Miltenyi		NK cell isolation method; another isolation instrument may be used
B-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free	Millipore Sigma	10775835001
CD107a APC antibody	Biolegend	328620
Cytokine 30-Plex Human Panel	Thermo Fisher Scientific	LHC6003M	chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used
FBS	Hyclone	SH30071.01
Goat anti-human κ light chain antibody	Millipore Sigma	AP502
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78440
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368814	cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol
IFN-ɣ primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00989291_m1
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier)	Greiner	227290
Lymphoprep (density gradient medium)	Stemcell	7851
MIP-1⍺ primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00234142_m1
MIP-1β primers	Thermo Fisher Scientific	Hs99999148_m1
NK cell isolation kit	Miltenyi	130-092-657	NK cell isolation kit; another isolation kit may be used
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific		another protein separation system may be used
pAKT (S473) antibody	Cell Signaling Technologies	4060
pERK1/2 antibody	Cell Signaling Technologies	4370
pPRAS40 antibody	Cell Signaling Technologies	13175
PVDF membrane	Thermo Fisher Scientific		nitrocellulose may be used
RANTES primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00982282_m1
RIPA buffer	Millipore Sigma	R0278
RPMI w/glutamax	Thermo Fisher Scientific	61870
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360070
TNF-⍺ primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00174128_m1
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	85111
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol
Xcell Blot II Transfer Module	Thermo Fisher Scientific		another protein separation system may be used
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System	Thermo Fisher Scientific		another protein separation system may be used
β-actin HRP antibody	Abcam	ab6721
β-actin primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00982282_m1