En protokol til undersøgelse af FcγRIIIa-drevne hændelser af terapeutiske antistoffer i menneskelige naturlige dræberceller er beskrevet her. Denne kunstige stimuleringsplatform gør det muligt at forhøre downstream-effektorfunktioner som degranulation, chemokin/cytokinproduktion og signalveje, der medieres af De Europæiske Forbindelser og Fc,som er forbundet med binding.
En virkningsmekanisme for klinisk effekt ved terapeutiske antistoffer er fremme af immunrelaterede funktioner, såsom cytokin sekretion og cytotoksicitet, drevet af FcγRIIIa (CD16) udtrykt på naturlige dræber (NK) celler. Disse observationer har ført til forskning med fokus på metoder til at øge Fc receptor-medieret begivenheder, som omfatter fjernelse af en fucose moiety fundet på Fc del af antistoffet. Yderligere undersøgelser har belyst de mekanistiske ændringer i signalering, cellulære processer og cytotoksiske egenskaber, der øger ADCC-aktiviteten med afucosylerede antistoffer. Derudover har andre undersøgelser vist de potentielle fordele ved disse antistoffer i kombination med små molekylehæmmere. Disse eksperimenter demonstrerede de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for fordelene ved at bruge afucosylerede antistoffer i kombinationsindstillinger. Mange af disse observationer var baseret på en kunstig in vitro aktivering assay, hvor FcγRIIIa på humane NK celler blev aktiveret af terapeutiske antistoffer. Denne analyse gav fleksibilitet til at studere downstream effektor NK celle funktioner, såsom cytokin produktion og degranulation. Derudover er denne analyse blevet brugt til at afhøre signalveje og identificere molekyler, der kan moduleres eller bruges som biomarkører. Endelig er andre terapeutiske molekyler (dvs. små molekylehæmmere) blevet tilføjet til systemet for at give indsigt i kombinationen af disse terapeutiske lægemidler med terapeutiske antistoffer, hvilket er afgørende i det nuværende kliniske rum. Dette manuskript har til formål at give et teknisk grundlag for at udføre denne kunstige menneskelige NK celle aktivering assay. Protokollen demonstrerer vigtige trin for celleaktivering samt potentielle downstream-applikationer, der spænder fra funktionelle udlæsninger til mere mekanistiske observationer.
I løbet af de sidste par årtier har der været enormt fokus på at udvikle målrettede kræftbehandlinger ved hjælp af antistoffer. Terapeutiske antistoffer, såsom trastuzumab og rituximab, opererer gennem flere mekanismer, herunder forebyggelse af dimerisering af signalmolekyler og mobilisering af immunsystemet1,2. Sidstnævnte opnås gennem antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC), hvor lymfocytter kaldet naturlige dræberceller (NK) bringes til en målcelle af antistoffet1,2. Ved at placere cellerne i nærheden af hinanden aktiveres NK-cellen og kan lyse en tumor / målcelle gennem udskillelsen af effektormolekyler3.
På molekylært niveau binder Fab-delen af antistoffet sit cognate antigen udtrykt på tumorcellerne, mens dets Fc-del engagerer FcγRIIIa udtrykt på NK-celler for at bringe de to celler sammen1,2. Efter engagement af FcγRIIIa, signalering veje (dvs. MAPK og PI3K veje) drev cytoskeletal omlægning, cytokin produktion, og cytotoksicitet4,5,6,7,8,9. Således er ADCC en FcγRIIIa-drevet begivenhed medieret af NK-celler og antistoffer.
Fordi ADCC blev anset for at være en virkningsmekanisme for disse terapeutiske antistoffer, forskere søgte efter metoder til at øge ADCC ved at ændre antistoffet. En ændring var fjernelsen af fucose på oligosaccharid kæde knyttet til asparagine 297, hvilket øger den bindende affinitet af Fc del af antistoffet til FcγRIIIa10,11,12. I dyreforsøg udviste mus, der fik afukosylerede antistoffer, langsommere tumorvækst sammenlignet med mus, der blev behandlet med dets fucosylerede modstykke13. Endnu vigtigere, obinutuzumab (f.eks Gazyva, en godkendt afucosyleret antistof) viste bedre effekt i forhold til rituximab (f.eks Rituxan, dens fucosylated modstykke) hos patienter diagnosticeret med kronisk lymfocytisk leukæmi eller follikulær lymfom14,15.
Indtil for nylig var de mekanismer, der lå til grund for øget ADCC via afucosylerede antistoffer, ukendte. Kombineret med det faktum, at der er mange forskningsprogrammer, der udvikler terapeutiske antistoffer til at udnytte FcγRIIIa-drevne mekanismer til at målrette kræftceller, er det bydende nødvendigt at udvikle in vitro-analyser, der undersøger de molekylære og cellulære aspekter, der fremmes af disse antistoffer. Dette giver grundlæggende forståelse af virkningsmekanismerne samt potentialet til at opdage biomarkører. Som sådan blev der udviklet en kunstig aktiveringsanalyse til undersøgelse af antistofafhængige FcγRIIIa-medierede funktioner ud over signalerings- og cellulære egenskaber8. Gennem disse undersøgelser er de mekanismer, der ligger til grund for øget effekt af afucosylerede antistoffer, blevet belyst, hvor øget bindende affinitet øger signalerne for at fremme cellulære egenskaber og cytotoksiske egenskaber8.
Den nuværende tendens i kliniske forsøg er brug af en kombination af terapeutiske molekyler16. En af de mest almindeligt muterede veje er PI3K-stien, som har gjort en enorm indsats for at udvikle små molekylehæmmere, der er målrettet komponenter i denne vej17,18,19,20. Men hvordan disse molekyler virker i kombination med terapeutiske antistoffer er relativt ukendt, især i kombinationer, hvor hæmmeren kan påvirke molekyler, der kræver PI3K-vejen for at fungere, såsom dem, der drives af terapeutiske antistoffer.
Med henblik herpå er in vitro-analysen, der anvendes til de afucosylerede antistofundersøgelser, også blevet anvendt til at studere kombinationen af PI3K-hæmmere og terapeutiske antistoffer. Disse undersøgelser definerede de molekylære egenskaber ved PI3K-hæmning på terapeutiske antistof-PI3K-drevne hændelser og beskrev, hvordan afucosylerede antistoffer kan opveje dette tab af signalering9. Disse resultater er relevante, da de giver potentiel vejledning til design af kliniske forsøg. Derudover førte denne serie af eksperimenter også til de første beskrevne observationer til kinetisk regulering af PI3K-signalvejen til modulering af chemokin /cytokintransskription og produktion, som kan tjene som potentielle biomarkører9.
Den kunstige in vitro-aktiveringsanalyse, der anvendes til at definere de signal- og cellulære egenskaber, der er beskrevet ovenfor, er designet til at studere FcγRIIIa-drevne hændelser i NK-celler medieret af antistoffer i mangel af målceller. Uden målceller i systemet kan alle de observerede signalhændelser og funktioner henføres direkte til NK-cellerne. I den præsenterede analyse tilsættes antistof til rensede NK-celler, hvorefter Fc-delen binder FcγRIIIa. Dette efterfølges af krydslinking af antistoffet ved hjælp af et anti-humant κ lyskædeantistof til kunstigt at stimulere cellerne. Krydslinking af antistoffet efterligner binding af målantigen for at generere en signalplatform, der fremkalder downstream-hændelser. Afhængigt af stimuleringens længde kan forskere vurdere signalering, cellulære processer, cytotoksiske egenskaber og effektorfunktioner8,9. Tilsvarende giver denne analyse også fleksibilitet i studiet af disse hændelser, når antistoffer kombineres med andre molekyler9.
Sammen er dette en ideel in vitro-analyse til at studere terapeutiske antistoffer, der fremkalder NK-cellerespons gennem deres FcγRIIIa som en del af virkningsmekanismen. Denne protokol beskriver udførelsen af denne in vitro aktivering assay og giver indsigt i de forskellige udlæsninger, der kan udføres.
Denne protokol beskriver metoder til undersøgelse af FcγRIIIa-drevne hændelser i NK-celler medieret af antistoffer. Disse teknikker gør det muligt at vurdere potentielle virkningsmekanismer for terapeutiske antistoffer, som foreslås at være ADCC1,2. Specifikt giver disse metoder fleksibilitet i studiet af underliggende molekylære signalveje og cellulære processer, der er ansvarlige for ADCC. De tillader også observation af andre effektorfunktioner, såsom chemokin og cytokinproduktion. Derudover gør disse metoder det muligt at identificere potentielle biomarkører og molekyler, der kan målrettes mod at modulere ADCC.
Grundlaget for denne protokol er den kunstige stimulering af NK-celler gennem FcγRIIIa med antistoffer i mangel af målceller. Antistofbundne målceller tjener typisk til at fremme krydskædningen af Fc-receptorer for at danne en platform, der driver signalering og downstream-effekter. I stedet, crosslinking opnås ved hjælp af en anti-human κ lyskæde antistof i denne analyse, uden om behovet for målceller til at stimulere NK celler. Uden målceller kan resultaterne og observationerne tilskrives direkte NK-cellerne, forudsat at rensningsprocessen er vellykket.
Det er vigtigt, at ved hjælp af anti-human κ lyskæde antistof til at krydse antistoffet ikke forstyrrer den bindende affinitet af Fc del for FcγRIIIa, en interaktion, der dikterer styrken af respons10,11,12,13. Undersøgelser har faktisk vist, at afucosylerede antistoffer øger ADCC på grund af deres øgede affinitet for FcγRIIIa10,11,12,13. Efterfølgende undersøgelser viste, at denne øgede affinitet ikke påvirkes af anti-human κ light chain sekundær antistoferstatning og kan bruges til at studere grundlaget for øget ADCC8. For at sikre, at NK-cellen stimuleres gennem krydslinking af antistoffet, bør der kun medtages to negative kontroller: 1) kun terapeutisk antistof uden det sekundære anti-humane κ lyskædeantistof og 2) kun det sekundære anti-humane κ light chain antistof. I begge tilfælde bør der ikke genereres nogen signal- eller effektorfunktion.
Denne metode giver også fleksibilitet til at studere virkningerne af terapeutiske antistoffer på små molekylehæmmere. Hæmmeren kan tilsættes, før den krydser med det sekundære antistof, så hæmmeren har tid til at engagere sit mål. Der bør dog udføres undersøgelser for at bestemme den optimale tid for forbehandling af hæmmeren; således har hæmmeren en maksimal effekt på stimuleringen. Med det sagt, forskere kan også vælge at studere virkningerne af en hæmmer efter stimulering. I dette tilfælde kan hæmmeren tilføjes efter crosslinking for at studere, hvordan det påvirker signaler og processer, der allerede er genereret. Sammen giver den metode, der er beskrevet her, maksimal fleksibilitet i studiet af kombinatoriske virkninger af forskellige småmolekylehæmmere med terapeutiske antistoffer.
Som nævnt ovenfor kan en række udlæsninger udføres efter stimulering. Vestlig blotting kan udføres for at studere signalering ved hjælp af SDS-PAGE og membranoverførselssystemer fra forskellige leverandører. På samme måde kan genekspression også vurderes ved hjælp af forskellige RNA-ekstraktionsmetoder, omvendte transskriptionsreagenser og genekspressionsinstrumenter. Endelig kan farvning for intracellulært eller ekstracellulært protein også udføres, hvor prøver kan analyseres ved hjælp af forskellige flowcytometre. For intracellulær cytokin og CD107a farvning (trin 3.4, som kan vurderes samtidigt), skal der tilføjes monensin og/eller brefeldin A for at maksimere signalerne. Vi har brugt forskellige platforme til hvert eksperimentelt mål og observerede stadig lignende resultater. Derfor kan metoden suppleres med forskellige reagenser, platforme og instrumenter, afhængigt af undersøgelsen.
Den tværgående tid til stimulering vil afhænge af målet med undersøgelsen. Hvis der ønskes signalstudier, er den typiske stimuleringstid på tværs af 2 min. og 10 min. pAKT, pPRAS40 og pERK1/2 akkumulering topper ved 2 min og forsvinder efter 10min. 8,9. For funktionelle undersøgelser (dvs. dem, der involverer chemokin /cytokinproduktion), skal cellerne stimuleres i mindst 30 min, afhængigt af analysanden9. Genekspression analyse kræver også typisk 30 min stimulation9. Forsigtighed bør udvises, når der anvendes RANTES-genekspression som udlæsning, da RANTES mRNA-produktionen er uafhængig af transskriptionsaktivering, da den allerede er lagret i celler til hurtig oversættelse og frigivelse af protein ved stimulering25. Degranulation, derimod, kræver mindst 3 timers stimulering. På trods af disse generelle observationer bør forskere udføre kinetiske undersøgelser for at bestemme den optimale stimuleringstid for de særlige molekyler af interesse.
På samme måde bør forskerne titrere antistoffet af interesse for at bestemme den optimale koncentration, fordi antistoffer med forskellige specificiteter binder sig til FcγRIIIa med forskellige tilhørsforhold, selvom de er af samme isotype. For eksempel er rituximab og trastuzumab begge en IgG1 isotype, men trastuzumab binder sig stærkere til valinepolymorfien i FcγRIIIa end rituximab26,27. Denne forskel i affinitet kan føre til funktionelle forskelle, såsom degranulation, som observeret i offentliggjorte undersøgelser8.
Bestemmelse af den optimale koncentration er også vigtigt på grund af den lave affinitet Fc del af antistoffet har for FcγRIIIa. Dette kan resultere i afvask af antistoffet, da protokollen omfatter vasketrin efter binding af antistoffet til Fc-receptoren. Dette kan derefter føre til manglende følsomhed i analyserne som foreslået af den lave procentdel af CD107a positive celler efter stimulering (Figur 5). Fastsættelsen af den optimale koncentration bør dog give tillid til, at resultaterne ikke skyldes manglende følsomhed. Desuden aktiveres cellerne tydeligt i de biokemiske og funktionelle analyser, der anvender bulkcelle i modsætning til enkeltcelleudlæsninger (Figur 2, Figur 3, Figur 6).
Protokollen er også begrænset, da den ikke helt efterligner, hvad der sker fysiologisk. Den sekundære anti-humane K antistof anvendes er at efterligne crosslinking genereret af mål antigen udtrykt på celler. Her tilsættes en mættende mængde sekundært antistof for at generere det maksimale respons. Men, særskilte målceller vil udtrykke forskellige niveauer af antigen, som vil påvirke crosslinking og respons. I øjeblikket er denne platform ikke optimeret til at efterligne virkningerne af forskellige antigenudtryksniveauer.
En anden faktor at overveje, når de udfører disse eksperimenter er donor-til-donor variabilitet på grund af forskellige genetiske baggrunde og immunologiske historier blandt enkeltpersoner. Derfor skal man være forsigtig, når man sammenligner NK celle svar fra forskellige donorer på tværs af de samme analyser. På samme måde bør der kun drages generelle konklusioner, når der anvendes forskellige donorer.
Alt i alt er den beskrevne metode en enkel og fleksibel stimuleringsplatform til at studere antistofdrevne FcγRIIIa-medierede hændelser i NK-celler. Det er blevet brugt til bedre at forstå grundlaget for den øgede ADCC og effekt observeret med afucosylerede antistoffer8. Denne metode blev også anvendt i en undersøgelse, der kombinerer terapeutiske antistoffer og PI3K små molekylehæmmere9. Derudover blev en hidtil ukendt mekanisme til chemokin- og cytokinproduktion reguleret af pS6 identificeret9. Derfor kan fremtidige undersøgelser ved hjælp af denne kunstige signalplatform yderligere belyse reguleringsmekanismer for effektorfunktioner drevet af FcγRIIIa. Det kan også potentielt identificere nye molekyler, der er vigtige for disse mekanismer samt nye roller for kendte molekyler.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker James Lee og Christopher Ng for kommentarer og redigering af dette manuskript.
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |