Bedömning av mänskliga naturliga mördarcellhändelser som drivs av FcγRIIIa-engagemang i närvaro av terapeutiska antikroppar

Summary

Ett protokoll för att studera FcγRIIIa-drivna händelser av terapeutiska antikroppar i mänskliga naturliga mördarceller beskrivs här. Denna artificiella stimuleringsplattform tillåter förhör av nedströms effektor funktioner såsom degranulering, chemokine/cytokin produktion, och signalering vägar medieras av FcγRIIIa och Fc delar av antikroppar som deltar i bindning.

Abstract

En verkningsmekanism för klinisk effekt av terapeutiska antikroppar är främjandet av immunrelaterade funktioner, såsom cytokinsekretion och cytotoxicitet, driven av FcγRIIIa (CD16) uttryckt på naturliga mördarceller (NK). Dessa observationer har lett till forskning med fokus på metoder för att öka Fc-receptormedierade händelser, som inkluderar avlägsnande av en fucose moiety som finns på Fc-delen av antikroppen. Ytterligare studier har belyst de mekanistiska förändringarna i signalering, cellulära processer och cytotoxiska egenskaper som ökar ADCC-aktiviteten med afukosylerade antikroppar. Dessutom har andra studier visat de potentiella fördelarna med dessa antikroppar i kombination med små molekylhämmare. Dessa experiment visade de molekylära och cellulära mekanismerna bakom fördelarna med att använda afukosylerade antikroppar i kombinationsinställningar. Många av dessa observationer baserades på en artificiell in vitro aktiveringsanalys där FcγRIIIa på mänskliga NK-celler aktiverades av terapeutiska antikroppar. Denna analys gav flexibiliteten att studera nedströms effektor NK cell funktioner, såsom cytokin produktion och degranulation. Dessutom har denna analys använts för att förhöra signalvägar och identifiera molekyler som kan moduleras eller användas som biomarkörer. Slutligen har andra terapeutiska molekyler (dvs. små molekylhämmare) lagts till i systemet för att ge insikter i kombinationen av dessa terapier med terapeutiska antikroppar, vilket är viktigt i det nuvarande kliniska utrymmet. Detta manuskript syftar till att ge en teknisk grund för att utföra denna konstgjorda mänskliga NK-cellaktiveringsanalys. Protokollet visar viktiga steg för cellaktivering samt potentiella nedströms program som sträcker sig från funktionella avläsningar till mer mekanistiska observationer.

Introduction

Under de senaste decennierna har det varit enormt fokus på att utveckla riktade cancerbehandlingar med hjälp av antikroppar. Terapeutiska antikroppar, såsom trastuzumab och rituximab, verkar genom flera mekanismer, inklusive förebyggande av dimerisering av signalmolekyler och mobilisering av immunsystemet^1,2. Det senare uppnås genom antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC), där lymfocyter som kallas naturliga mördarceller (NK) förs till en målcell av antikroppen^1,2. Genom att placera cellerna i närheten av varandra aktiveras NK-cellen och kan lysa en tumör/målcell genom utsöndring av effektormolekyler³.

På molekylär nivå binder Fab-delen av antikroppen sitt kognateantigen uttryckt på tumörcellerna, medan dess Fc-del engagerar FcγRIIIa uttryckt på NK-celler för att sammanföra de två cellerna^1,2. Efter engagemang av FcγRIIIa driver signalvägar (dvs MAPK- och PI3K-vägar) cytoskeletal omorganisering, cytokinproduktion och cytotoxicitet^4,5,6,7,8,9. Således är ADCC en FcγRIIIa-driven händelse medierad av NK-celler och antikroppar.

Eftersom ADCC ansågs vara en verkningsmekanism för dessa terapeutiska antikroppar sökte forskare efter metoder för att öka ADCC genom att modifiera antikroppen. En ändring var avlägsnandet av fucose på oligosackariderkedjan fäst vid asparagin 297, vilket ökar den bindande affiniteten hos Fc-delen av antikroppen till FcγRIIIa^10,11,12. I djurstudier uppvisade möss som fick afukosylerade antikroppar långsammare tumörtillväxt jämfört med möss som behandlats med dess fukosylerade motsvarighet¹³. Ännu viktigare är att obinutuzumab (t.ex. Gazyva, en godkänd afukosylerad antikropp) visade bättre effekt i förhållande till rituximab (t.ex. Rituxan, dess fukosylerade motsvarighet) hos patienter som diagnostiserats med kronisk lymfatisk leukemi eller follikulärt lymfom^14,15.

Fram till nyligen var mekanismerna bakom ökad ADCC via afukosylerade antikroppar okända. I kombination med det faktum att det finns många forskningsprogram som utvecklar terapeutiska antikroppar för att använda FcγRIIIa-drivna mekanismer för att rikta in sig på cancerceller, är det absolut nödvändigt att utveckla in vitro-analyser som undersöker de molekylära och cellulära aspekter som främjas av dessa antikroppar. Detta ger grundläggande förståelse för verkmekanismerna och potentialen att upptäcka biomarkörer. Som sådan utvecklades en artificiell aktiveringsanalys för att studera antikroppsberoende FcγRIIIa-medierade funktioner utöver signal- och cellegenskaper⁸. Genom dessa studier har de mekanismer som ligger till grund för ökad effekt av afukosylerade antikroppar klarlagts där ökad bindningstillhörighet ökar signalerna för att främja cellulära egenskaper och cytotoxiska egenskaper⁸.

Den nuvarande trenden i kliniska prövningar är användning av en kombination av terapeutiska molekyler¹⁶. En av de vanligaste muterade vägarna är PI3K-vägen, vilket har lett till enorma ansträngningar för att utveckla små molekylhämmare som riktar sig till komponenter i denna väg^17,18,19,20. Ändå är hur dessa molekyler fungerar i kombination med terapeutiska antikroppar relativt okänt, särskilt i kombinationer där hämmaren kan påverka molekyler som kräver PI3K-vägen för att fungera, såsom de som drivs av terapeutiska antikroppar.

För detta ändamål har den in vitro-analys som använts för de afukosylerade antikroppsstudierna också använts för att studera kombinationen av PI3K-hämmare och terapeutiska antikroppar. Dessa studier definierade de molekylära egenskaperna hos PI3K-hämning på terapeutiska antikropps PI3K-drivna händelser och beskrev hur afukosylerade antikroppar kan kompensera denna förlust av signalering⁹. Dessa resultat är relevanta eftersom de ger potentiell vägledning för att utforma kliniska prövningar. Dessutom ledde denna serie experiment också till de första beskrivna observationerna för kinetisk reglering av PI3K-signalvägen för att modulera chemokine/ cytokin transkription och produktion, som kan fungera som potentiella biomarkörer⁹.

Den artificiella in vitro-aktiveringsanalys som används för att definiera signal- och cellulära egenskaper som beskrivs ovan har utformats för att studera FcγRIIIa-drivna händelser i NK-celler som förmedlas av antikroppar i avsaknad av målceller. Utan målceller i systemet kan alla signalhändelser och funktioner som observerats tillskrivas NK-cellerna direkt. I den presenterade analysen tillsätts antikropp till renade NK-celler, då Fc-delen binder FcγRIIIa. Detta följs av korslänkning av antikroppen med hjälp av en anti-human κ ljuskedjeantikropp för att artificiellt stimulera cellerna. Korslänkning av antikroppen efterliknar bindning av målantigenet för att generera en signalplattform som framkallar händelser nedströms. Beroende på stimuleringens längd kan forskare bedöma signalering, cellulära processer, cytotoxiska egenskaper och effektorfunktioner^8,9. På samma sätt ger denna analys också flexibilitet vid studier av dessa händelser när antikroppar kombineras med andra molekyler⁹.

Tillsammans är detta en idealisk in vitro-analys för att studera terapeutiska antikroppar som framkallar NK-cellsvar genom deras FcγRIIIa som en del av verkningsmekanismen. Det här protokollet beskriver prestanda för den här in vitro-aktiveringsanalysen och ger insikt i de olika avläsningar som kan utföras.

Protocol

Följande protokoll är i enlighet med riktlinjerna från iQ Biosciences etikkommitté för mänsklig forskning. 1. Isolering av pbbc och anrikning/rening av NK-celler OBS: Andra metoder för isolering av perifera blod mononukleära celler (PBMCs) och berikning/rening kan också utföras. Dra 200 ml blod under reglerade förhållanden till ett rör som innehåller heparin. Tillsätt 15 ml av densitetsgradientmediet i ett 50 ml-rör med en porös barriär inkorporerad. Snurra röret vid 1000 x g i 30 s. Tillsätt 12,5 ml blod i röret följt av ytterligare 12,5 ml PBS och vänd försiktigt 3x. Snurra röret vid 800 x g i 15 minuter vid rumstemperatur (RT) utan pauser. Förbered ett koniskt rör på 50 ml med 40 ml PBS för varje rör med en porös barriär medan cellerna snurrar. Ta försiktigt bort rören och inspektera efter centrifugering. Kontrollera om det finns ett tunt, synligt vitt lager pbbc ovanför den porösa barriären, mellan 20 mL och 25 ml avgränsningar på 50 ml-röret. Ta försiktigt bort så mycket vätska som möjligt uppifrån med en pipett utan att störa det tunna, vita PBMC-skiktet. Med en ren serologisk pipett på 10 ml, ta försiktigt bort PBMC-skiktet utöver det klara, gulaktiga vätskeskiktet ner till rörets filter. Utvisa pbbc och vätska i 50 ml konisk innehållande PBS som bereds i steg 1.4. Spinnrör på RT och 300 x g i 5 min. Aspirera PBS-tvätten och tillsätt ytterligare 40 ml PBS. Spinnrör på RT och 300 x g i 5 min. Efter tvätt, räkna cellerna och återanvända dem i 40 μL av 2% BSA/PBS per 1 x 107 celler. Fortsätt till isolering av NK-celler med hjälp av den metod som valts. Alternativen inkluderar manuell eller automatiserad magnetisk pärlbaserad sortering9,21. Fluorescensaktiverad cellsortering kan också utföras22. Ta bort en liten alikvot av celler för att bestämma renheten hos NK-celler genom flödescytometri. Gating-strategin inkluderar följande: gate på levande celler baserat på framåt vs. sidospridningsprofil och utvärdera sedan renheten baserat på NK-markörer (t.ex. CD3, CD56) i den specifika levande populationen. Typisk renhet är >95%. När isoleringen är klar, spinnceller på RT och 300 x g i 5 min till pellet och aspirate. Återsuspendera cellpelleten till 1 x 107 celler/ml i RPMI 1640 med näringsämnen, 10% värmeinaktiverad FBS, 1 mM natrium pyruvat, 55 mM 2-ME och 10 mM HEPES (pH = 7,2). 2. Antikroppsmedierad aktivering av NK-celler via FcγRIIIa Ställ in en kyld mikrocentrifuge på 4 °C. Dispensera 1 x 106 (100 μL) återanvända NK-celler till 1,5 ml rör och placera på is.OBS: Celler kan dispenseras till en 96 väl U-bottenplatta om det finns många prover. Förbered 1 μL av 100 μg/mL rituximab (eller antikropp av intresse) per prov och tillsätt 1 μL till cellerna för en slutlig koncentration av 1 μg/ml antikropp.OBS: Andra molekyler kan tillsättas cellerna vid denna tidpunkt eller tidigare för bedömning av kombinationseffekter. Här användes ritixumab för stimulering. I tidigare studier har små molekylhämmare tillsatts till stimuleringar9. Inkubera provet på is i 30 minuter. Under inkubation bereder du 50 μL av 50 μg/ml anti-human κ ljuskedjeantikropp per prov i media och värm till 37 °C på ett värmeblock eller i ett vattenbad. Efter inkubation av celler på is, tillsätt 1 ml iskallt medium och snurra vid 135 x g i 5 min vid 4 °C. Tvätta igen med 1 ml iskylmedel. Aspirera på supernatanten efter den sista tvätten och tillsätt 50 μL av den antimänskliga κ-lättkedjeblandningen som bereds i steg 2,5. Inkubera omedelbart prover för slutanvändaren fastställda tidspunkter vid 37 °C på ett värmeblock eller i ett vattenbad. Stoppa stimuleringen genom att tillsätta 1 ml iskallt medium och snurra omedelbart prover i en kyld centrifug vid 135 x g i 5 minuter. Tvätta en gång till med 1 ml iskall media. 3. Program och avläsningar nedströms Förhör av signalmolekyler i FcγRIIIa-stimulerade NK-celler genom western blot-analysOBS: Olika proteinseparations- och membranöverföringsapparater kan användas. Efter den sista tvättningen med iskalla medier (steg 2.8) blandas lysceller med 20 μL RIPA-buffert innehållande fosfatas- och proteashämmare i 30 minuter på is. Spinnrör vid 2100 x g i 15 min vid 4 °C. Överför lysat till ett rent 1,5 ml-rör och tillsätt de reagenser som krävs för proteinseparation. Separera proteiner på SDS-PAGE gel och överför till ett nitrocellulosa- eller PVDF-membran enligt standardprotokoll. Blockera och sondera membranet enligt tillverkarens datablad för den primära detektionsantikroppen (här användes pAKT, pPRAS 40 och pERK1/2). Tillsätt HRP konjugerad sekundär antikropp och chemiluminescensreagens enligt tillverkarens rekommendationer om PVDF-membranet. Använd röntgenfilm eller detektionsinstrument för att visualisera (här upptäcktes pAKT vid 60 kDa, pPRAS40 vid 40 kDa och pERK1/2 vid 42 kDa och 44 kDa). Isolering av mRNA och förberedelse för genuttrycksanalys av FcγRIIIa-stimulerade NK-celler (Tabell över material) När tidpunkten för stimulering har uppnåtts (steg 2.7), placera röret på is och snurra omedelbart i en kyld centrifug vid 135 x g i 5 min (liknar steg 2,8). Ta bort supernatanten och tvätta 2x med 1 ml iskall PBS. Lyse celler med guanidium isotiocyanate RNA extraktion(Tabell av material). Använd 1 μg mRNA för att utföra omvänd transkription med slumpmässiga hexamers med ett kommersiellt kit(Table of Materials).OBS: Alla metoder för RNA-extraktion eller cDNA-syntes kan användas9,23,24. Frys cDNA vid -20 °C tills genuttrycksanalys. Cytoskeletal omorganiseringsbedömning i FcγRIIIa-stimulerade NK-celler Efter den sista tvättningen med iskalla medier (steg 2.8) återanvänder cellpelleten med 50 μL av 3,7% paraformaldehyd i 10 min vid RT. Tillsätt 1 mL PBS och snurra vid 135 x g i 5 min vid RT. Upprepa denna tvätt en gång till. Tillsätt 100 μL 0,1% Triton X-100/PBS i 5 minuter för att permeabilisera celler och snurra celler vid 135 x g i 5 min vid RT till pellet. Tillsätt 100 μL 5 enheter/ml AF488-märkt falloidin utspädd i 1% BSA/PBS och inkubera i 20 min vid RT. Tillsätt 1 ml PBS och snurra vid 135 x g i 5 min vid RT för att tvätta. Återanvänd cellpelleten i önskad volym för flödescytometrisk analys. Bedömning av aväppning av FcγRIIIa-stimulerade NK-celler med CD107a ytfärgning Inkubera cellerna med den antikropp av intresse på is som beskrivs i steg 2.1–2.4. Under inkubation bereder du 50 μL antikroppsblandning per prov. Förbered blandningen i cellmedier med en slutlig koncentration på 50 μg/ml anti-human κ ljuskedjeantikropp och 1 μg/ml fluorokrommärkt CD107a. Efter inkubation av cellerna på is, tillsätt 1 ml iskall media. Snurra vid 135 x g i 5 min vid 4 °C och tvätta sedan igen med 1 ml iskyla medier. Aspirera på supernatanten efter den sista tvättningen, tillsätt sedan 50 μL av den anti-mänskliga κ-lättkedjeblandningen och inkubera vid 37 °C för önskade tidpunkter. Vid önskade tidpunkter tillsätt 1 ml PBS och snurra vid 135 x g i 5 min vid RT. Aspirate supernatant och tillsätt 100 μL 4% paraformaldehyd. Inkubera på RT i 10 min. Tillsätt 1 ml PBS och snurra vid 135 x g i 5 min vid RT för att tvätta. Återanvänd cellpelleten i önskad volym för flödescytometrisk analys. Bedömning av chemokine/cytokinproduktion från FcγRIIIa-stimulerade NK-cellerOBS: Olika metoder och/eller satser kan användas för bedömning av chemokine- och cytokinproduktion. När stimuleringstiden har uppnåtts (steg 2.7) placera omedelbart röret på is och snurra i en kyld centrifug vid 135 x g i 5 min vid 4 °C. Överför supernatanten till ett rent kärl. Frys supernatanten tills chemokine- eller cytokinbedömning med önskad analys.OBS: Cellpellets kan nu tvättas med iskall PBS och bearbetas för signalering, genuttryck och cytoskeletal omorganiseringsstudier.

Representative Results

Det är viktigt att NK-cellsrenhet är hög eftersom Fc-delen av antikropparna kan binda FcγRIIIa uttryckt på andra celltyper, såsom monocyter. Med hög renhet kan de observationer som gjorts hänföras direkt till FcγRIIIa-drivna händelser i NK-celler. Här hade NK-celler större än 90% renhet baserat på CD56- och CD3-fläckar(figur 1). Dessutom var lönsamheten >95%. Försiktighet bör användas vid användning av isoleringar med lägre livskraft. För att säkerställa att händelserna kördes av FcγRIIIa utfördes västra fläckar för phospho-AKT (pAKT), phospho-PRAS40 (pPRAS40) och phospho-ERK1/2 (pERK1/2), där NK-celler aktiverades i 1-5 min. Som visats observerades en ackumulering av dessa molekyler (figur 2). På samma sätt uttryckte aktiverade NK-celler MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ och TNF-α, vilket framgår av genuttrycksanalys(figur 3). Dessutom observerades cytoskeletal omorganisering i aktiverade celler (figur 4). En procentandel av NK-cellerna stimulerade i 4 timmar uttryckte CD107a på cellytan (figur 5). Dessutom upptäcktes IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β och RANTES i supernatanten efter 3 h stimulering(figur 6). Dessa avläsningar förväntas baserat på publicerade studier eftersom aktiverade NK-celler kommer att ha dessa fosforylerade proteiner, liksom genuttryck och produktion av nämnda kemokkiner och cytokiner8,9. I alla experiment bör stimuleringsförhållandena omfatta en anti-human κ ljuskedja endast kontroll och antikropp utan anti-human κ ljus tvärbindning kontroll. Dessa NK-celler bör inte visa några fospho-signalering, degranulation, chemokine/cytokinproduktion eller chemokine/cytokin genuttryck. Figur 1: Representativa flödesprofiler för NK-cellsrenhet efter isolering från PBBC. PBMCs isolerades från blod från en frisk givare, följt av berikning av NK-celler med en negativ urvalsmetod för mänsklig NK-cellisolering(Tabell över material). Celler färgades med CD56 och CD3 före och efter berikning för att bestämma renhet. Representativa prickdiagram av CD56 vs. CD3 före och efter isolering. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 2: FcγRIIIa-aktiverade NK-celler uppvisar fosforylerade signalmolekyler. Cellerna stimulerades med rituximab i 2 min, och cell lysates gjordes enligt protokollet. Lysates separerades på en 4%-12% gel, följt av överföring till ett PVDF-membran. Membranet undersöktes med antikroppar mot pAKT, pPRAS40, pERK1/2 och aktin. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 3: FcγRIIIa-aktiverade NK-celler uttrycker kemokin- och cytokingener. NK-celler stimulerades med rituximab i 0 h, 0, 5 h och 1 h. mRNA samlades in, omvändtranskriberades och utsattes för qPCR-analys för MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ och TNF-α(Tabell över material). ( A)Relativt uttryck för MIP-1α, MIP-1β och RANTES vid varje tidpunkt. b)Relativt uttryck för IFN-γ och TNF-α vid varje tidpunkt. Värden normaliserades till aktin genen. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 4: FcγRIIIa-aktiverade NK-celler uppvisar cytoskeletal omorganisering. NK celler stimulerades med rituximab för 0 min, 5 min, 15 min och 30 min, följt av bedömning för cytoskeletal omorganisering genom falloidin färgning och flöde cytometry. Förhållandet mellan MFI vid experimentell tidpunkt och MFI vid tidpunkt 0 av NK-celler stimulerade med rituximab (cirkel, solid linje) eller sekundär antikropp ensam (kvadratisk, prickad linje). Staplar representerar SD för fyra replikat. Asterisker representerar statistisk signifikans baserad på en tvåsidigt oparad Students t-test (*p < 0,05). Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 5: FcγRIIIa-aktiverade NK-celler uttrycker CD107a. NK celler stimulerades med rituximab för 4 h följt av bedömning för avdäppning av CD107a och flöde cytometry. ( A) Procentandel av NK-celler som uttrycker CD107a efter stimulering med rituximab (vita stänger) eller anti-human κ ljuskedjeantikropp (grå stänger) i 0 h och 4 h. (B) CD107a MFI av NK-celler stimulerade med rituximab (vita stänger) eller anti-human κ ljuskedjeantikropp (grå stänger) efter 0 h och 4 h behandling. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 6: FcγRIIIa-aktiverade NK-celler utsöndrar kemoker och cytokiner. NK celler stimulerades för 0, 0,5, 1, 3 och 6 timmar med rituximab. Supernatant samlades in för att mäta frisättning av MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ och TNF-α med en flödes- och pärlbaserad cytokinbedömningsmetod(Tabell över material). A) MIP-1α, MIP-1β och RANTES-produktion vid varje tidpunkt. b)IFN-γ och TNF-α produktion vid varje tidpunkt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Detta protokoll beskriver metoder för att studera FcγRIIIa-drivna händelser i NK-celler medierade av antikroppar. Dessa tekniker tillåter utvärdering av potentiella verkningsmekanismer hos terapeutiska antikroppar, vilket föreslås vara ADCC^1,2. Specifikt ger dessa metoder flexibilitet vid studier av underliggande molekylära signalvägar och cellulära processer som ansvarar för ADCC. De tillåter också observation av andra effektorfunktioner, såsom kemokin och cytokinproduktion. Dessutom möjliggör dessa metoder identifiering av potentiella biomarkörer och molekyler som kan vara inriktade på att modulera ADCC.

Grunden för detta protokoll är artificiell stimulering av NK-celler genom FcγRIIIa med antikroppar i avsaknad av målceller. Antikroppsbundna målceller tjänar vanligtvis till att främja korslänkning av Fc-receptorer för att bilda en plattform som driver signalering och nedströmseffekter. Istället sker korslänkning med hjälp av en anti-human κ ljuskedjeantikropp i denna analys, vilket kringgår behovet av målceller för att stimulera NK-cellerna. Utan målceller kan resultaten och observationerna hänföras direkt till NK-cellerna, förutsatt att reningsprocessen lyckas.

Viktigt är att användning av anti-human κ ljuskedjeantikropp för att korslänka antikroppen stör inte den bindande affiniteten hos Fc-delen för FcγRIIIa, en interaktion som dikterar styrkan i svar^10,11,12,13. Studier har faktiskt visat att afukosylerade antikroppar ökar ADCC på grund av deras ökade affinitet för FcγRIIIa^10,11,12,13. Efterföljande studier visade att denna ökade affinitet inte påverkas av den anti-mänskliga κ lätta kedjan sekundära antikroppsersättning och kan användas för att studera grunden för ökad ADCC⁸. För att säkerställa att NK-cellen stimuleras genom korslänkning av antikroppen bör två negativa kontroller inkluderas: 1) terapeutisk antikropp endast utan den sekundära anti-humana κ-ljuskedjeantikroppen och 2) den sekundära anti-mänskliga κ-ljuskedjeantikroppen endast. I båda fallen bör ingen signal- eller effektorfunktion genereras.

Denna metod ger också flexibilitet för att studera effekterna av terapeutiska antikroppar på små molekylhämmare. Inhibitoren kan tillsättas innan den korslänkas med den sekundära antikroppen så att inhibitoren hinner engagera sitt mål. Studier bör dock utföras för att bestämma den optimala tiden för förbehandling av inhibitorer. hämmaren har således en maximal effekt på stimuleringen. Med det sagt kan forskare också välja att studera effekterna av en hämmare efter stimulering. I detta fall kan hämmaren läggas till efter korslänkning för att studera hur det påverkar signaler och processer som redan genereras. Tillsammans ger metoden som beskrivs här maximal flexibilitet vid studier av kombinatoriska effekter av olika små molekylhämmare med terapeutiska antikroppar.

Som nämnts ovan kan en mängd avläsningar utföras efter stimulering. Western blotting kan utföras för att studera signalering med hjälp av SDS-PAGE och membranöverföringssystem från olika leverantörer. På samma sätt kan genuttryck också bedömas med hjälp av olika RNA-extraktionsmetoder, omvända transkriptionsreagenser och genuttrycksinstrument. Slutligen kan färgning för intracellulärt eller extracellulärt protein också utföras där prover kan analyseras med hjälp av olika flödescytometrar. För intracellulär cytokin och CD107a färgning (steg 3.4, som kan bedömas samtidigt), ska monensin och/eller brefeldin A tillsättas för att maximera signalerna. Vi har använt olika plattformar för varje experimentellt mål och fortfarande observerat liknande resultat. Därför kan metoden kompletteras med olika reagenser, plattformar och instrument, beroende på studien.

Den tvärbindningstiden för stimulering beror på studiens mål. Om signalstudier önskas är typisk korslänkning stimuleringstid mellan 2 min och 10 min. pAKT, pPRAS40 och pERK1/2 ackumuleringstoppar vid 2 min och försvinner efter 10 min^8,9. För funktionella studier (dvs. de som omfattar chemokine/cytokinproduktion) måste cellerna stimuleras i minst 30 minuter, beroende på analyt⁹. Genuttrycksanalys kräver också vanligtvis 30 min stimulering⁹. Försiktighet bör iakttas vid användning av RANTES genuttryck som avläsning, eftersom RANTES mRNA-produktion är oberoende av transkriptionell aktivering eftersom den redan lagras i celler för snabb översättning och frisättning av protein vid stimulering²⁵. Avidentifiering kräver däremot minst 3 h stimulering. Trots dessa allmänna observationer bör forskare utföra kinetiska studier för att bestämma den optimala stimuleringstiden för de specifika molekylerna av intresse.

På samma sätt bör forskare titrera den antikropp som är av intresse för att bestämma den optimala koncentrationen eftersom antikroppar med olika specificiteter binder till FcγRIIIa med olika affiniteter, även om de är av samma isotyp. Till exempel är rituximab och trastuzumab båda en IgG1-isotyp men trastuzumab binder starkare till valinpolymorfismen hos FcγRIIIa än rituximab^26,27. Denna skillnad i affinitet kan leda till funktionella skillnader, såsom avdäppning, som observerats i publicerade studier⁸.

Att bestämma den optimala koncentrationen är också viktigt på grund av den låga affinitet som Fc-delen av antikroppen har för FcγRIIIa. Detta kan leda till att antikroppen tvättas eftersom protokollet inkluderar tvättsteg efter bindning av antikroppen till Fc-receptorn. Detta kan sedan leda till en brist på känslighet i analyserna som föreslås av den låga andelen CD107a positiva celler efter stimulering (figur 5). Bestämning av den optimala koncentrationen bör dock ge förtroende för att resultaten inte beror på brist på känslighet. Dessutom aktiveras cellerna tydligt i de biokemiska och funktionella analyser som använder bulkcell i motsats till encellsläsningar (figur 2, figur 3, figur 6).

Protokollet är också begränsat eftersom det inte helt efterliknar vad som sker fysiologiskt. Den sekundära anti-humanA K-antikroppen som används är att imitera korslänkningen som genereras av målantigen uttryckt på celler. Här tillsätts en mättande mängd sekundär antikropp för att generera maximalt svar. Distinkta målceller kommer dock att uttrycka olika nivåer av antigen, vilket kommer att påverka korslänkning och respons. För närvarande är denna plattform inte optimerad för att efterlikna effekterna av olika antigenuttrycksnivåer.

En annan faktor att tänka på när man utför dessa experiment är variabilitet mellan donatorer och donator på grund av olika genetiska bakgrunder och immunologiska historier bland individer. Därför måste man vara försiktig när man jämför NK-cellsvar från olika givare i samma analyser. På samma sätt bör endast allmänna slutsatser dras när olika givare används.

Sammantaget är den beskrivna metoden en enkel och flexibel stimuleringsplattform för att studera antikroppsdrivna FcγRIIIa-medierade händelser i NK-celler. Det har använts för att bättre förstå grunden för den ökade ADCC och effekt som observerats med afukosylerade antikroppar⁸. Denna metod användes också i en studie som kombinerar terapeutiska antikroppar och PI3K små molekylhämmare⁹. Dessutom identifierades en tidigare okänd mekanism för kemokin- och cytokinproduktion som regleras av pS6⁹. Därför kan framtida studier med denna artificiella signalplattform ytterligare klargöra regleringsmekanismer för effektorfunktioner som drivs av FcγRIIIa. Det kan också potentiellt identifiera nya molekyler som är viktiga för dessa mekanismer samt nya roller för kända molekyler.

Materials

16% paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	50-980-487
Alexa Fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
anti-mouse HRP antibody	Cell Signaling Technologies	7076
AutoMACS instrument	Miltenyi		NK cell isolation method; another isolation instrument may be used
B-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free	Millipore Sigma	10775835001
CD107a APC antibody	Biolegend	328620
Cytokine 30-Plex Human Panel	Thermo Fisher Scientific	LHC6003M	chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used
FBS	Hyclone	SH30071.01
Goat anti-human κ light chain antibody	Millipore Sigma	AP502
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Fisher Scientific	78440
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630080
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368814	cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol
IFN-ɣ primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00989291_m1
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier)	Greiner	227290
Lymphoprep (density gradient medium)	Stemcell	7851
MIP-1⍺ primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00234142_m1
MIP-1β primers	Thermo Fisher Scientific	Hs99999148_m1
NK cell isolation kit	Miltenyi	130-092-657	NK cell isolation kit; another isolation kit may be used
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific		another protein separation system may be used
pAKT (S473) antibody	Cell Signaling Technologies	4060
pERK1/2 antibody	Cell Signaling Technologies	4370
pPRAS40 antibody	Cell Signaling Technologies	13175
PVDF membrane	Thermo Fisher Scientific		nitrocellulose may be used
RANTES primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00982282_m1
RIPA buffer	Millipore Sigma	R0278
RPMI w/glutamax	Thermo Fisher Scientific	61870
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360070
TNF-⍺ primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00174128_m1
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	85111
TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018	RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol
Xcell Blot II Transfer Module	Thermo Fisher Scientific		another protein separation system may be used
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System	Thermo Fisher Scientific		another protein separation system may be used
β-actin HRP antibody	Abcam	ab6721
β-actin primers	Thermo Fisher Scientific	Hs00982282_m1