Ett protokoll för att studera FcγRIIIa-drivna händelser av terapeutiska antikroppar i mänskliga naturliga mördarceller beskrivs här. Denna artificiella stimuleringsplattform tillåter förhör av nedströms effektor funktioner såsom degranulering, chemokine/cytokin produktion, och signalering vägar medieras av FcγRIIIa och Fc delar av antikroppar som deltar i bindning.
En verkningsmekanism för klinisk effekt av terapeutiska antikroppar är främjandet av immunrelaterade funktioner, såsom cytokinsekretion och cytotoxicitet, driven av FcγRIIIa (CD16) uttryckt på naturliga mördarceller (NK). Dessa observationer har lett till forskning med fokus på metoder för att öka Fc-receptormedierade händelser, som inkluderar avlägsnande av en fucose moiety som finns på Fc-delen av antikroppen. Ytterligare studier har belyst de mekanistiska förändringarna i signalering, cellulära processer och cytotoxiska egenskaper som ökar ADCC-aktiviteten med afukosylerade antikroppar. Dessutom har andra studier visat de potentiella fördelarna med dessa antikroppar i kombination med små molekylhämmare. Dessa experiment visade de molekylära och cellulära mekanismerna bakom fördelarna med att använda afukosylerade antikroppar i kombinationsinställningar. Många av dessa observationer baserades på en artificiell in vitro aktiveringsanalys där FcγRIIIa på mänskliga NK-celler aktiverades av terapeutiska antikroppar. Denna analys gav flexibiliteten att studera nedströms effektor NK cell funktioner, såsom cytokin produktion och degranulation. Dessutom har denna analys använts för att förhöra signalvägar och identifiera molekyler som kan moduleras eller användas som biomarkörer. Slutligen har andra terapeutiska molekyler (dvs. små molekylhämmare) lagts till i systemet för att ge insikter i kombinationen av dessa terapier med terapeutiska antikroppar, vilket är viktigt i det nuvarande kliniska utrymmet. Detta manuskript syftar till att ge en teknisk grund för att utföra denna konstgjorda mänskliga NK-cellaktiveringsanalys. Protokollet visar viktiga steg för cellaktivering samt potentiella nedströms program som sträcker sig från funktionella avläsningar till mer mekanistiska observationer.
Under de senaste decennierna har det varit enormt fokus på att utveckla riktade cancerbehandlingar med hjälp av antikroppar. Terapeutiska antikroppar, såsom trastuzumab och rituximab, verkar genom flera mekanismer, inklusive förebyggande av dimerisering av signalmolekyler och mobilisering av immunsystemet1,2. Det senare uppnås genom antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC), där lymfocyter som kallas naturliga mördarceller (NK) förs till en målcell av antikroppen1,2. Genom att placera cellerna i närheten av varandra aktiveras NK-cellen och kan lysa en tumör/målcell genom utsöndring av effektormolekyler3.
På molekylär nivå binder Fab-delen av antikroppen sitt kognateantigen uttryckt på tumörcellerna, medan dess Fc-del engagerar FcγRIIIa uttryckt på NK-celler för att sammanföra de två cellerna1,2. Efter engagemang av FcγRIIIa driver signalvägar (dvs MAPK- och PI3K-vägar) cytoskeletal omorganisering, cytokinproduktion och cytotoxicitet4,5,6,7,8,9. Således är ADCC en FcγRIIIa-driven händelse medierad av NK-celler och antikroppar.
Eftersom ADCC ansågs vara en verkningsmekanism för dessa terapeutiska antikroppar sökte forskare efter metoder för att öka ADCC genom att modifiera antikroppen. En ändring var avlägsnandet av fucose på oligosackariderkedjan fäst vid asparagin 297, vilket ökar den bindande affiniteten hos Fc-delen av antikroppen till FcγRIIIa10,11,12. I djurstudier uppvisade möss som fick afukosylerade antikroppar långsammare tumörtillväxt jämfört med möss som behandlats med dess fukosylerade motsvarighet13. Ännu viktigare är att obinutuzumab (t.ex. Gazyva, en godkänd afukosylerad antikropp) visade bättre effekt i förhållande till rituximab (t.ex. Rituxan, dess fukosylerade motsvarighet) hos patienter som diagnostiserats med kronisk lymfatisk leukemi eller follikulärt lymfom14,15.
Fram till nyligen var mekanismerna bakom ökad ADCC via afukosylerade antikroppar okända. I kombination med det faktum att det finns många forskningsprogram som utvecklar terapeutiska antikroppar för att använda FcγRIIIa-drivna mekanismer för att rikta in sig på cancerceller, är det absolut nödvändigt att utveckla in vitro-analyser som undersöker de molekylära och cellulära aspekter som främjas av dessa antikroppar. Detta ger grundläggande förståelse för verkmekanismerna och potentialen att upptäcka biomarkörer. Som sådan utvecklades en artificiell aktiveringsanalys för att studera antikroppsberoende FcγRIIIa-medierade funktioner utöver signal- och cellegenskaper8. Genom dessa studier har de mekanismer som ligger till grund för ökad effekt av afukosylerade antikroppar klarlagts där ökad bindningstillhörighet ökar signalerna för att främja cellulära egenskaper och cytotoxiska egenskaper8.
Den nuvarande trenden i kliniska prövningar är användning av en kombination av terapeutiska molekyler16. En av de vanligaste muterade vägarna är PI3K-vägen, vilket har lett till enorma ansträngningar för att utveckla små molekylhämmare som riktar sig till komponenter i denna väg17,18,19,20. Ändå är hur dessa molekyler fungerar i kombination med terapeutiska antikroppar relativt okänt, särskilt i kombinationer där hämmaren kan påverka molekyler som kräver PI3K-vägen för att fungera, såsom de som drivs av terapeutiska antikroppar.
För detta ändamål har den in vitro-analys som använts för de afukosylerade antikroppsstudierna också använts för att studera kombinationen av PI3K-hämmare och terapeutiska antikroppar. Dessa studier definierade de molekylära egenskaperna hos PI3K-hämning på terapeutiska antikropps PI3K-drivna händelser och beskrev hur afukosylerade antikroppar kan kompensera denna förlust av signalering9. Dessa resultat är relevanta eftersom de ger potentiell vägledning för att utforma kliniska prövningar. Dessutom ledde denna serie experiment också till de första beskrivna observationerna för kinetisk reglering av PI3K-signalvägen för att modulera chemokine/ cytokin transkription och produktion, som kan fungera som potentiella biomarkörer9.
Den artificiella in vitro-aktiveringsanalys som används för att definiera signal- och cellulära egenskaper som beskrivs ovan har utformats för att studera FcγRIIIa-drivna händelser i NK-celler som förmedlas av antikroppar i avsaknad av målceller. Utan målceller i systemet kan alla signalhändelser och funktioner som observerats tillskrivas NK-cellerna direkt. I den presenterade analysen tillsätts antikropp till renade NK-celler, då Fc-delen binder FcγRIIIa. Detta följs av korslänkning av antikroppen med hjälp av en anti-human κ ljuskedjeantikropp för att artificiellt stimulera cellerna. Korslänkning av antikroppen efterliknar bindning av målantigenet för att generera en signalplattform som framkallar händelser nedströms. Beroende på stimuleringens längd kan forskare bedöma signalering, cellulära processer, cytotoxiska egenskaper och effektorfunktioner8,9. På samma sätt ger denna analys också flexibilitet vid studier av dessa händelser när antikroppar kombineras med andra molekyler9.
Tillsammans är detta en idealisk in vitro-analys för att studera terapeutiska antikroppar som framkallar NK-cellsvar genom deras FcγRIIIa som en del av verkningsmekanismen. Det här protokollet beskriver prestanda för den här in vitro-aktiveringsanalysen och ger insikt i de olika avläsningar som kan utföras.
Detta protokoll beskriver metoder för att studera FcγRIIIa-drivna händelser i NK-celler medierade av antikroppar. Dessa tekniker tillåter utvärdering av potentiella verkningsmekanismer hos terapeutiska antikroppar, vilket föreslås vara ADCC1,2. Specifikt ger dessa metoder flexibilitet vid studier av underliggande molekylära signalvägar och cellulära processer som ansvarar för ADCC. De tillåter också observation av andra effektorfunktioner, såsom kemokin och cytokinproduktion. Dessutom möjliggör dessa metoder identifiering av potentiella biomarkörer och molekyler som kan vara inriktade på att modulera ADCC.
Grunden för detta protokoll är artificiell stimulering av NK-celler genom FcγRIIIa med antikroppar i avsaknad av målceller. Antikroppsbundna målceller tjänar vanligtvis till att främja korslänkning av Fc-receptorer för att bilda en plattform som driver signalering och nedströmseffekter. Istället sker korslänkning med hjälp av en anti-human κ ljuskedjeantikropp i denna analys, vilket kringgår behovet av målceller för att stimulera NK-cellerna. Utan målceller kan resultaten och observationerna hänföras direkt till NK-cellerna, förutsatt att reningsprocessen lyckas.
Viktigt är att användning av anti-human κ ljuskedjeantikropp för att korslänka antikroppen stör inte den bindande affiniteten hos Fc-delen för FcγRIIIa, en interaktion som dikterar styrkan i svar10,11,12,13. Studier har faktiskt visat att afukosylerade antikroppar ökar ADCC på grund av deras ökade affinitet för FcγRIIIa10,11,12,13. Efterföljande studier visade att denna ökade affinitet inte påverkas av den anti-mänskliga κ lätta kedjan sekundära antikroppsersättning och kan användas för att studera grunden för ökad ADCC8. För att säkerställa att NK-cellen stimuleras genom korslänkning av antikroppen bör två negativa kontroller inkluderas: 1) terapeutisk antikropp endast utan den sekundära anti-humana κ-ljuskedjeantikroppen och 2) den sekundära anti-mänskliga κ-ljuskedjeantikroppen endast. I båda fallen bör ingen signal- eller effektorfunktion genereras.
Denna metod ger också flexibilitet för att studera effekterna av terapeutiska antikroppar på små molekylhämmare. Inhibitoren kan tillsättas innan den korslänkas med den sekundära antikroppen så att inhibitoren hinner engagera sitt mål. Studier bör dock utföras för att bestämma den optimala tiden för förbehandling av inhibitorer. hämmaren har således en maximal effekt på stimuleringen. Med det sagt kan forskare också välja att studera effekterna av en hämmare efter stimulering. I detta fall kan hämmaren läggas till efter korslänkning för att studera hur det påverkar signaler och processer som redan genereras. Tillsammans ger metoden som beskrivs här maximal flexibilitet vid studier av kombinatoriska effekter av olika små molekylhämmare med terapeutiska antikroppar.
Som nämnts ovan kan en mängd avläsningar utföras efter stimulering. Western blotting kan utföras för att studera signalering med hjälp av SDS-PAGE och membranöverföringssystem från olika leverantörer. På samma sätt kan genuttryck också bedömas med hjälp av olika RNA-extraktionsmetoder, omvända transkriptionsreagenser och genuttrycksinstrument. Slutligen kan färgning för intracellulärt eller extracellulärt protein också utföras där prover kan analyseras med hjälp av olika flödescytometrar. För intracellulär cytokin och CD107a färgning (steg 3.4, som kan bedömas samtidigt), ska monensin och/eller brefeldin A tillsättas för att maximera signalerna. Vi har använt olika plattformar för varje experimentellt mål och fortfarande observerat liknande resultat. Därför kan metoden kompletteras med olika reagenser, plattformar och instrument, beroende på studien.
Den tvärbindningstiden för stimulering beror på studiens mål. Om signalstudier önskas är typisk korslänkning stimuleringstid mellan 2 min och 10 min. pAKT, pPRAS40 och pERK1/2 ackumuleringstoppar vid 2 min och försvinner efter 10 min8,9. För funktionella studier (dvs. de som omfattar chemokine/cytokinproduktion) måste cellerna stimuleras i minst 30 minuter, beroende på analyt9. Genuttrycksanalys kräver också vanligtvis 30 min stimulering9. Försiktighet bör iakttas vid användning av RANTES genuttryck som avläsning, eftersom RANTES mRNA-produktion är oberoende av transkriptionell aktivering eftersom den redan lagras i celler för snabb översättning och frisättning av protein vid stimulering25. Avidentifiering kräver däremot minst 3 h stimulering. Trots dessa allmänna observationer bör forskare utföra kinetiska studier för att bestämma den optimala stimuleringstiden för de specifika molekylerna av intresse.
På samma sätt bör forskare titrera den antikropp som är av intresse för att bestämma den optimala koncentrationen eftersom antikroppar med olika specificiteter binder till FcγRIIIa med olika affiniteter, även om de är av samma isotyp. Till exempel är rituximab och trastuzumab båda en IgG1-isotyp men trastuzumab binder starkare till valinpolymorfismen hos FcγRIIIa än rituximab26,27. Denna skillnad i affinitet kan leda till funktionella skillnader, såsom avdäppning, som observerats i publicerade studier8.
Att bestämma den optimala koncentrationen är också viktigt på grund av den låga affinitet som Fc-delen av antikroppen har för FcγRIIIa. Detta kan leda till att antikroppen tvättas eftersom protokollet inkluderar tvättsteg efter bindning av antikroppen till Fc-receptorn. Detta kan sedan leda till en brist på känslighet i analyserna som föreslås av den låga andelen CD107a positiva celler efter stimulering (figur 5). Bestämning av den optimala koncentrationen bör dock ge förtroende för att resultaten inte beror på brist på känslighet. Dessutom aktiveras cellerna tydligt i de biokemiska och funktionella analyser som använder bulkcell i motsats till encellsläsningar (figur 2, figur 3, figur 6).
Protokollet är också begränsat eftersom det inte helt efterliknar vad som sker fysiologiskt. Den sekundära anti-humanA K-antikroppen som används är att imitera korslänkningen som genereras av målantigen uttryckt på celler. Här tillsätts en mättande mängd sekundär antikropp för att generera maximalt svar. Distinkta målceller kommer dock att uttrycka olika nivåer av antigen, vilket kommer att påverka korslänkning och respons. För närvarande är denna plattform inte optimerad för att efterlikna effekterna av olika antigenuttrycksnivåer.
En annan faktor att tänka på när man utför dessa experiment är variabilitet mellan donatorer och donator på grund av olika genetiska bakgrunder och immunologiska historier bland individer. Därför måste man vara försiktig när man jämför NK-cellsvar från olika givare i samma analyser. På samma sätt bör endast allmänna slutsatser dras när olika givare används.
Sammantaget är den beskrivna metoden en enkel och flexibel stimuleringsplattform för att studera antikroppsdrivna FcγRIIIa-medierade händelser i NK-celler. Det har använts för att bättre förstå grunden för den ökade ADCC och effekt som observerats med afukosylerade antikroppar8. Denna metod användes också i en studie som kombinerar terapeutiska antikroppar och PI3K små molekylhämmare9. Dessutom identifierades en tidigare okänd mekanism för kemokin- och cytokinproduktion som regleras av pS69. Därför kan framtida studier med denna artificiella signalplattform ytterligare klargöra regleringsmekanismer för effektorfunktioner som drivs av FcγRIIIa. Det kan också potentiellt identifiera nya molekyler som är viktiga för dessa mekanismer samt nya roller för kända molekyler.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar James Lee och Christopher Ng för kommentarer och redigering av detta manuskript.
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |