En protokoll for å studere FcγRIIIa-drevne hendelser ved terapeutiske antistoffer i naturlige drapsceller er beskrevet her. Denne kunstige stimuleringsplattformen tillater avhør av nedstrøms effektorfunksjoner som degranulering, kjemokin/cytokinproduksjon og signalveier formidlet av FcγRIIIa- og Fc-delene av antistoffer involvert i binding.
En virkningsmekanisme for klinisk effekt av terapeutiske antistoffer er fremme av immunrelaterte funksjoner, som cytokinsekresjon og cytotoksisitet, drevet av FcγRIIIa (CD16) uttrykt på naturlige morderceller (NK). Disse observasjonene har ført til forskning med fokus på metoder for å øke Fc reseptormediert hendelser, som inkluderer fjerning av en fucose moiety funnet på Fc delen av antistoffet. Videre studier har belyst de mekanistiske endringene i signalering, cellulære prosesser og cytotoksiske egenskaper som øker ADCC-aktiviteten med afukosylerte antistoffer. I tillegg har andre studier vist de potensielle fordelene ved disse antistoffene i kombinasjon med små molekylhemmere. Disse eksperimentene demonstrerte de molekylære og cellulære mekanismene som ligger til grunn for fordelene ved å bruke afukosylerte antistoffer i kombinasjonsinnstillinger. Mange av disse observasjonene var basert på en kunstig in vitro-aktiveringsanalyse der FcγRIIIa på humane NK-celler ble aktivert av terapeutiske antistoffer. Denne analysen ga fleksibiliteten til å studere nedstrøms effekteller NK-cellefunksjoner, for eksempel cytokinproduksjon og degranulering. I tillegg har denne analysen blitt brukt til å forhøre signalveier og identifisere molekyler som kan moduleres eller brukes som biomarkører. Til slutt har andre terapeutiske molekyler (dvs. små molekylhemmere) blitt lagt til systemet for å gi innsikt i kombinasjonen av disse terapeutiske med terapeutiske antistoffer, noe som er viktig i det nåværende kliniske rommet. Dette manuskriptet tar sikte på å gi et teknisk grunnlag for å utføre denne kunstige menneskelige NK-celleaktiveringsanalysen. Protokollen demonstrerer viktige trinn for celleaktivering samt potensielle nedstrømsprogrammer som spenner fra funksjonelle avlesninger til mer mekanistiske observasjoner.
I løpet av de siste tiårene har det vært et enormt fokus på å utvikle målrettede kreftbehandlinger ved hjelp av antistoffer. Terapeutiske antistoffer, som trastuzumab og rituksimab, opererer gjennom flere mekanismer, inkludert forebygging av dimerisering av signalmolekyler og mobilisering av immunsystemet1,2. Sistnevnte oppnås gjennom antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC), der lymfocytter kalt naturlige morderceller (NK) bringes til en målcelle av antistoffet1,2. Ved å plassere cellene i nærheten av hverandre, aktiveres NK-cellen og kan lyse en svulst / målcelle gjennom sekresjonen av effektormolekyler3.
På molekylært nivå binder Fab-delen av antistoffet sitt konjakkantigen uttrykt på tumorcellene, mens Fc-delen engasjerer FcγRIIIa uttrykt på NK-celler for å bringe de to cellene sammen1,2. Etter engasjement av FcγRIIIa, signaliserende veier (dvs. MAPK og PI3K veier) kjøre cytoskeletal omorganisering, cytokin produksjon, og cytotoksisitet4,5,6,7,8,9. Dermed er ADCC en FcγRIIIa-drevet hendelse formidlet av NK-celler og antistoffer.
Fordi ADCC ble antatt å være en virkningsmekanisme for disse terapeutiske antistoffene, søkte forskere etter metoder for å øke ADCC ved å modifisere antistoffet. En modifikasjon var fjerning av fucose på oligosakkaridkjeden festet til asparagin 297, noe som øker bindingsaffiniteten til Fc-delen av antistoffet til FcγRIIIa10,11,12. I dyrestudier viste mus som fikk afukosylerte antistoffer langsommere tumorvekst sammenlignet med mus behandlet med sin fucosylerte motpart13. Enda viktigere, obinutuzumab (f.eks. Gazyva, et godkjent afukosylert antistoff) viste bedre effekt i forhold til rituksimab (f.eks. Rituxan, dets fucosylerte motstykke) hos pasienter diagnostisert med kronisk lymfocytisk leukemi eller follikulær lymfom14,15.
Inntil nylig var mekanismene som lå til grunn for økt ADCC via afukosylerte antistoffer ukjente. Kombinert med det faktum at det er mange forskningsprogrammer som utvikler terapeutiske antistoffer for å bruke FcγRIIIa-drevne mekanismer for å målrette kreftceller, er det viktig å utvikle in vitro-analyser som undersøker de molekylære og cellulære aspektene som fremmes av disse antistoffene. Dette gir grunnleggende forståelse av virkningsmekanismer samt potensialet til å oppdage biomarkører. Som sådan ble en kunstig aktiveringsanalyse utviklet for å studere antistoffavhengige FcγRIIIa-medierte funksjoner i tillegg til signalering og cellulære egenskaper8. Gjennom disse studiene har mekanismene som ligger til grunn for økt effekt av afukosylerte antistoffer blitt belyst der forbedret bindende affinitet øker signalisering for å fremme cellulære egenskaper og cytotoksiske egenskaper8.
Den nåværende trenden i kliniske studier er bruk av en kombinasjon av terapeutiskemolekyler 16. En av de mest muterte banene er PI3K-banen, som har ført til enorm innsats i å utvikle små molekylhemmere som retter seg mot komponenter i denne banen17,18,19,20. Likevel er hvordan disse molekylene virker i kombinasjon med terapeutiske antistoffer relativt ukjent, spesielt i kombinasjoner der inhibitoren kan påvirke molekyler som krever PI3K-banen for å fungere, for eksempel de som drives av terapeutiske antistoffer.
For dette formål har in vitro-analysen som brukes til de afukosylerte antistoffstudiene også blitt brukt til å studere kombinasjonen av PI3K-hemmere og terapeutiske antistoffer. Disse studiene definerte de molekylære egenskapene til PI3K-hemming på terapeutisk antistoff PI3K-drevne hendelser og beskrev hvordan afukosylerte antistoffer kan kompensere for dette tapet av signalering9. Disse funnene er relevante da de gir potensiell veiledning for å designe kliniske studier. I tillegg førte denne serien av eksperimenter også til de første beskrevne observasjonene for kinetisk regulering av PI3K-signalveien for å modulere kjemokin/cytokintranskripsjon og produksjon, som kan fungere som potensielle biomarkører9.
Den kunstige in vitro-aktiveringsanalysen som brukes til å definere signal- og cellulære egenskaper beskrevet ovenfor, er designet for å studere FcγRIIIa-drevne hendelser i NK-celler mediert av antistoffer i fravær av målceller. Uten målceller i systemet kan alle de observerte signalhendelsene og funksjonene tilskrives direkte til NK-cellene. I den presenterte analysen tilsettes antistoff til rensede NK-celler, og da binder Fc-delen Fc-delen FcγRIIIa. Dette etterfølges av krysskobling av antistoffet ved hjelp av et antimenneskelig κ lyskjede antistoff for å kunstig stimulere cellene. Krysskobling av antistoffet etterligner binding av målantigenet for å generere en signalplattform som fremkaller nedstrømshendelser. Avhengig av lengden på stimulering, kan forskere vurdere signalering, cellulære prosesser, cytotoksiske egenskaper og effektorfunksjoner8,9. På samme måte gir denne analysen også fleksibilitet i å studere disse hendelsene når antistoffer kombineres med andremolekyler 9.
Sammen er dette en ideell in vitro-analyse for å studere terapeutiske antistoffer som fremkaller NK-celleresponser gjennom deres FcγRIIIa som en del av virkningsmekanismen. Denne protokollen beskriver ytelsen til denne in vitro-aktiveringsanalysen og gir innsikt i de ulike avlesningene som kan utføres.
Denne protokollen beskriver metoder for å studere FcγRIIIa-drevne hendelser i NK-celler mediert av antistoffer. Disse teknikkene tillater evaluering av potensielle virkningsmekanismer for terapeutiske antistoffer, som foreslås å være ADCC1,2. Spesielt gir disse metodene fleksibilitet i å studere underliggende molekylære signalveier og cellulære prosesser som er ansvarlige for ADCC. De tillater også observasjon av andre effektorfunksjoner, som kjemokin og cytokinproduksjon. I tillegg tillater disse metodene identifisering av potensielle biomarkører og molekyler som kan være målrettet mot modulering av ADCC.
Grunnlaget for denne protokollen er kunstig stimulering av NK-celler gjennom FcγRIIIa med antistoffer i fravær av målceller. Antistoffbundne målceller tjener vanligvis til å fremme krysskoblingen av Fc-reseptorer for å danne en plattform som driver signalisering og nedstrømseffekter. I stedet oppnås krysskobling ved hjelp av et antimenneskelig κ lyskjedeantistoff i denne analysen, og omgår behovet for målceller for å stimulere NK-cellene. Uten målceller kan resultatene og observasjonene tilskrives direkte til NK-cellene, forutsatt at renseprosessen er vellykket.
Det er viktig at bruk av anti-menneskelig κ lyskjede antistoff for å krysslinke antistoffet ikke forstyrrer bindingsaffiniteten til Fc-delen for FcγRIIIa, en interaksjon som dikterer styrken av respons10,11,12,13. Faktisk har studier vist at afukosylerte antistoffer øker ADCC på grunn av deres økte affinitet for FcγRIIIa10,11,12,13. Påfølgende studier viste at denne økte affiniteten ikke påvirkes av den antimenneskelige κ lyskjede sekundære antistofferstatningen og kan brukes til å studere grunnlaget for økt ADCC8. For å sikre at NK-cellen stimuleres gjennom krysskobling av antistoffet, bør to negative kontroller bare inkluderes: 1) terapeutisk antistoff bare uten sekundært antimenneskets κ lyskjedeantistoff, og 2) bare det sekundære antimennesket κ lyskjedeantistoff. I begge tilfeller bør ingen signal- eller effektorfunksjon genereres.
Denne metoden gir også fleksibilitet til å studere effekten av terapeutiske antistoffer på små molekylhemmere. Inhibitoren kan tilsettes før krysskobling med det sekundære antistoffet slik at inhibitoren har tid til å engasjere sitt mål. Studier bør imidlertid utføres for å bestemme den optimale tiden for forbehandling av inhibitor; Dermed har inhibitoren en maksimal effekt på stimulering. Når det er sagt, kan forskere også velge å studere effekten av en inhibitor etter stimulering. I dette tilfellet kan inhibitoren legges til etter krysskobling for å studere hvordan den påvirker signaler og prosesser som allerede er generert. Sammen gir metoden beskrevet her maksimal fleksibilitet i å studere kombinatoriske effekter av forskjellige små molekylhemmere med terapeutiske antistoffer.
Som nevnt ovenfor kan en rekke avlesninger utføres etter stimulering. Vestlig blotting kan utføres for å studere signalering ved hjelp av SDS-PAGE og membranoverføringssystemer fra ulike leverandører. På samme måte kan genuttrykk også vurderes ved hjelp av ulike RNA-ekstraksjonsmetoder, reverstranskripsjonsreagenser og genuttrykksinstrumenter. Til slutt kan farging for intracellulært eller ekstracellulært protein også utføres der prøver kan analyseres ved hjelp av forskjellige strømningscytometere. For intracellulær cytokin- og CD107a-farging (trinn 3.4, som kan vurderes samtidig), bør monensin og/eller brefeldin A legges til for å maksimere signaler. Vi har brukt forskjellige plattformer for hvert eksperimentelt mål og fortsatt observert lignende resultater. Derfor kan metoden suppleres med ulike reagenser, plattformer og instrumenter, avhengig av studien.
Krysskoblingstiden for stimulering vil avhenge av målet med studien. Hvis signalstudier ønskes, er typisk krysskoblingstimuleringstid mellom 2 min og 10 min. pAKT, pPRAS40 og pERK1/2 akkumuleringsstopper på 2 min og forsvinner etter 10 min8,9. For funksjonelle studier (dvs. de som involverer kjemokin/cytokinproduksjon), må celler stimuleres i minst 30 min, avhengig av analytten9. Genuttrykksanalyse krever også vanligvis 30 min stimulering9. Forsiktighet bør utvises ved bruk av RANTES-genuttrykk som avlesning, da RANTES mRNA-produksjon er uavhengig av transkripsjonell aktivering siden den allerede er lagret i celler for rask oversettelse og frigjøring av protein ved stimulering25. Deriangulering krever derimot minst 3 timers stimulering. Til tross for disse generelle observasjonene, bør forskere utføre kinetiske studier for å bestemme den optimale stimuleringstiden for de spesielle molekylene av interesse.
På samme måte bør forskere titrate antistoffet av interesse for å bestemme den optimale konsentrasjonen fordi antistoffer med forskjellige spesifisiteter binder seg til FcγRIIIa med forskjellige affiniteter, selv om de er av samme isotype. For eksempel er rituksimab og trastuzumab begge en IgG1-isotype, men trastuzumab binder seg sterkere til valinpolymorfismen til FcγRIIIa enn rituksimab26,27. Denne forskjellen i affinitet kan føre til funksjonelle forskjeller, for eksempel degranulering, som observert i publiserte studier8.
Å bestemme den optimale konsentrasjonen er også viktig på grunn av den lave affiniteten Fc-delen av antistoffet har for FcγRIIIa. Dette kan føre til vasking av antistoffet siden protokollen inkluderer vasketrinn etter binding av antistoffet til Fc-reseptoren. Dette kan da føre til manglende følsomhet i analysene som antydet av den lave prosentandelen av CD107a positive celler etter stimulering (Figur 5). Bestemmelse av den optimale konsentrasjonen bør imidlertid gi tillit til at resultatene ikke skyldes mangel på følsomhet. I tillegg aktiveres celler tydelig i de biokjemiske og funksjonelle analysene som bruker bulkcelle i motsetning til enkeltcelleavlesninger (Figur 2, Figur 3, Figur 6).
Protokollen er også begrenset siden den ikke helt etterligner det som skjer fysiologisk. Det sekundære anti-menneskelige K-antistoffet som brukes er å etterligne krysskoblingen generert av målantigen uttrykt på celler. Her legges en mettende mengde sekundært antistoff for å generere maksimal respons. Imidlertid vil distinkte målceller uttrykke forskjellige nivåer av antigen, noe som vil påvirke krysskobling og respons. For tiden er denne plattformen ikke optimalisert for å etterligne effekten av forskjellige antigenuttrykksnivåer.
En annen faktor å vurdere når du utfører disse eksperimentene er donor-til-donor variasjon på grunn av ulike genetiske bakgrunner og immunologiske historier blant enkeltpersoner. Derfor må det utvises forsiktighet ved sammenligning av NK-celleresponser fra ulike givere på tvers av de samme analysene. På samme måte bør det bare gjøres generelle konklusjoner når forskjellige givere brukes.
Til sammen er den beskrevne metoden en enkel og fleksibel stimuleringsplattform for å studere antistoffdrevne FcγRIIIa-medierte hendelser i NK-celler. Det har blitt brukt til å bedre forstå grunnlaget for økt ADCC og effekt observert med afukosylerte antistoffer8. Denne metoden ble også brukt i en studie som kombinerer terapeutiske antistoffer og PI3K små molekylhemmere9. I tillegg ble en tidligere ukjent mekanisme for kjemokin og cytokinproduksjon regulert av pS6 identifisert9. Derfor kan fremtidige studier som bruker denne kunstige signalplattformen ytterligere belyse reguleringsmekanismer for effektorfunksjoner drevet av FcγRIIIa. Det kan også potensielt identifisere nye molekyler som er viktige for disse mekanismene, samt nye roller for kjente molekyler.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker James Lee og Christopher Ng for kommentarer og redigering av dette manuskriptet.
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |