इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्राथमिक सिलिया का सरल पता लगाना
Summary
प्राथमिक सिलिया सेंट्रियोल से जुड़ी बाहीय संरचनाएं हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंट स्टेनिंग द्वारा प्राथमिक सिलिया का पता लगाना एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है जिसके परिणामस्वरूप बेहद उच्च गुणवत्ता वाली छवियां होती हैं। इस प्रोटोकॉल में, प्राथमिक सिलिया को व्यक्त करने वाले फाइब्रोब्लास्ट को फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में स्थिर, इम्यूनोडांडित और इमेजकिया गया था।
Abstract
प्राथमिक सिलिया को कोशिका चक्र प्रगति के दौरान गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है, विशेष रूप से कोशिका चक्र के G0/G1 चरणों के दौरान, माइटोसिस से पहले फिर से आकार दिया जा रहा है। प्राथमिक सिलिया को अत्यधिक परिष्कृत तरीकों के साथ कल्पना की जा सकती है, जिसमें ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, 3 डी इमेजिंग, या प्राथमिक सिलिया का स्वचालित पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करना शामिल है। हालांकि, इन तरीकों को करने के लिए प्राथमिक सिलिया के इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला की आवश्यकता होती है। यह प्रकाशन एसिटिलेटेड अल्फा ट्यूबलिन (एक्सोनेम) और गामा ट्यूबलिन (बेसल शरीर) को धुंधला करके विट्रो में प्राथमिक सिलिया के आसानी से पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है और उच्च गुणवत्ता वाली छवियों में परिणाम है। वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि प्राथमिक सिलिया को व्यक्त करने वाली चार सेल लाइनें (C2C12, एमईएफ, एनएचएलएफ और त्वचा फाइब्रोब्लास्ट) को कैसे ठीक किया गया, इम्यूनोडांड किया गया, और फ्लोरोसेंट या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ इमेज किया गया।
Introduction
प्राथमिक सिलिया कोशिका की मां सेंट्रियोल से जुड़े संवेदी, एकान्त, झिल्ली से बंधे, गैर-असंभव संरचनाएं हैं। प्राथमिक सिलिया लाल रक्त कोशिकाओं, एडिपोसाइट्स1,और हेपेटोसाइट्स 2 के अपवाद के साथ अधिकांश कशेरुकी कोशिकाओं पर पाएजातेहैं। प्राथमिक सिलिया माइक्रोट्यूबुल्स द्वारा बनाई गई एक लम्बी एक्सोनमे के रूप में बनाई जाती है, जिसका मुख्य घटक α-ट्यूबलिन है। एक्सोनेम बेसल बॉडी से बढ़ता है, जिसे γ-ट्यूबलिन से संरचित किया जाता है। प्राथमिक सिलिया की लंबाई 2-10 माइक्रोन के बीच भिन्न होती है; हालांकि, ग्लाइसिलेशन, भुखमरी, हाइपोक्सिया, साइटोटॉक्सिक तनाव, या आयनीकरण विकिरण3,4,,5,,6,,7के संपर्क में आने के बाद इसके आयाम बदल सकते हैं।, आमतौर पर, कोशिकाओं में केवल एक प्राथमिक सिलियम होता है, जो कोशिका प्रसार और भेदभाव8,,9के लिए महत्वपूर्ण मॉर्फोजेनेसिस और सेल सिग्नलिंग रास्तों में शामिल होता है।
प्राथमिक सिलिया को कोशिका चक्र प्रगति के दौरान गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है, विशेष रूप से जी0/जी1 चरणों के दौरान, और एचडीएसी 6 (हिस्टोन डेसेटाइलेज 6)10द्वारा मध्यस्थता ट्यूबलिन डेसेटिलेशन से जुड़ी प्रक्रिया में माइटोसिस में प्रवेश करने से पहले फिर से आकार दिया जाता है। प्राथमिक सिलिया अवशोषण का सटीक क्षण कोशिका प्रकार और इस प्रक्रिया में सीधे शामिल जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, जैसे अरोड़ा ए, पीएलके 1, टीसी टेक्स-1 11,1112,,13।, सेल प्रकार के आधार पर, प्राथमिक सिलिया विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर्स, आयन चैनल और सक्रिय सिग्नलिंग रास्ते व्यक्त करते हैं। इनमें प्रसार और अस्तित्व को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण सिग्नलिंग रिसेप्टर्स, ईजीएफआर, पीडीजीएफआर और एफजीएफआर शामिल हैं। इसके अलावा कुछ सिग्नलिंग रास्ते भी शामिल हैं जो हेजहोग, नॉच और डब्ल्यूएनटी सहित एक या एक से अधिक अंगों के कार्य को प्रभावित कर सकते हैं। इन रिसेप्टर्स और सिग्नलिंग रास्तों के लिए धन्यवाद, प्राथमिक सिलिया भी एक रसायनकारण कार्य करते हैं। यह फ़ंक्शन प्राथमिक सिलिया को पायदान, हार्मोन और जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों जैसे सेरोटोनिन या सोमाटोस्टैटिन के लिए विशिष्ट लिगांड का पता लगाने की अनुमति देता है। विभिन्न लंबाई के प्राथमिक सिलिया द्वारा प्रदर्शित अन्य विशिष्ट कार्यों में तापमान, गुरुत्वाकर्षण और ओस्मोलिटी14में परिवर्तन की प्रतिक्रिया शामिल है।
प्राथमिक सिलिया को विभिन्न तरीकों जैसे लाइव विज़ुअलाइज़ेशन, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, 3 डी इमेजिंग, या प्राथमिक सिलिया,5, 15,,16,,17के स्वचालित पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा कल्पना की जा सकती है।17 हालांकि, इन तरीकों अत्यधिक विशिष्ट हैं और चल रहे अनुसंधान अनुसंधान के हर चरण में प्राथमिक सिलिया धुंधला करने के लिए बुनियादी, तेजी से, और आसान तरीकों की जरूरत है। वर्णित सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्राथमिक सिलिया का पता लगाने के लिए एक आसान और उपयोगी तरीका है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कई लेखकों ने प्राथमिक सिलिया का पता लगाने के लिए विविध तरीकों का वर्णन किया है, कभी-कभी विभिन्न निर्धारण विधियों का वर्णन भी किया है जो उनकी पहचान6,20, 21,,,22को प्रभावित कर …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चेक गणराज्य के रक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था – दीर्घकालिक संगठन विकास योजना सैन्य स्वास्थ्य विज्ञान संकाय, रक्षा विश्वविद्यालय के सामूहिक विनाश के हथियारों के चिकित्सा पहलू; शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय, चेक गणराज्य (विशिष्ट अनुसंधान परियोजना नहीं: SV/FVZ201703) और PROGRES Q40/06 । अंग्रेजी भाषा संशोधन में अपनी तरह की सहायता के लिए डैनियल डियाज़ को भी धन्यवाद।
Materials
| 6-well plate | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Rabbit IgG |
| Anti-Tubulin γ | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (mouse) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (whole molecule) F(ab′)2 fragment–Cy3 antibody produced in sheep |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s medium | Thermo Scientific | 11960044 | High glucose, No glutamine, Gibco |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662 | With MgCl2 and CaCl2, Sterile-filtered, Suitable for cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | 16000044 | Sterile-Filtered, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Mouse embryonic fibroblast |
| Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | Monoclonal Anti-Acetylated Tubulin antibody produced in mouse |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Primary lung fibroblasts (human) |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Powder |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Skin fibroblasts | Kindly gifted from Charles University, Faculty of Medicine in Hradec Králové. | ||
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Borosilicate glass, 22x22mm, Square |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Sterile-Filtered, Gibco |
References
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a “sleeping beauty” in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Sloboda, R. . Primary cilia. , (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677 (2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905 (2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1 (2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381 (2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5 (2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11 (2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
