这里介绍的是使用声学分离器对CHO细胞培养进行初步澄清的方案。该协议可用于摇瓶培养物或生物反应器收获的初级澄清,并且具有在灌注生物反应器操作期间连续澄清细胞出血材料的潜在应用。
初级澄清是生物制造过程中必不可少的步骤,用于从收获的细胞培养液中的治疗产物中初始去除细胞。虽然离心或过滤等传统方法被广泛用于细胞去除,但这些过程的设备占地面积大,操作可能涉及污染风险和过滤器结垢。此外,传统方法可能不适合用于初级澄清的连续生物工艺方案。因此,研究了使用声(声)波的替代应用,以连续地将细胞与细胞培养液分离。本研究提出了一个详细的方案,用于使用实验室规模的声波分离器(AWS)从CHO细胞生物反应器收获中对含有单克隆IgG1抗体的培养液进行一次分离。AWS 提供了具有代表性的数据,并演示了如何实现有效的单元澄清和产品恢复。最后,讨论了 AWS 在连续生物处理中的潜在应用。总体而言,本研究为在 CHO 细胞培养的初级澄清中实施 AWS 提供了实用的通用方案,并进一步描述了其在连续生物工艺中的应用潜力。
在涉及分泌的治疗蛋白的生物制造过程中,一个关键步骤是从收获的细胞培养液(HCCF)中去除生物质。传统上,生物制造商在生产单克隆抗体时采用离心和深度过滤作为其主要澄清方法1。然而,离心可能导致细胞上的高剪切应力,导致HCCF中的细胞碎片增加。这可能导致过滤器在过滤过程中结垢,并导致额外的污染物后过滤,从而降低下游色谱效率1,2,3。此外,为特定过程定制离心机可能成本高昂,并且可能需要额外的连接到原位清洗和原位灭菌系统,这也可能是可扩展性的限制因素。使用深度过滤器可以补偿离心的限制,并利用一次性技术4。然而,深度过滤器主要用作二次澄清,因为它们无法承受高细胞培养密度5。或者,已采用切向流动过滤(TFF)细胞保留装置来减轻剪切应力,但可能会遇到诸如膜极化和收获率低等挑战6。使用离心加深度过滤或TFF引起的上述问题为改进HCCF的初级澄清过程创造了机会。
声学分离被引入为一种可用于从具有高质量蛋白质产物的细胞培养物中收获分泌蛋白质的技术7,8。声学分离是通过与悬浮流体和保留粒子相互作用的多维驻波的传播和反射来实现的9,10。这些粒子经历三种力:流体阻力,重力和声辐射。当每个力彼此均匀相对,达到平衡时,粒子被悬浮并捕获在超声波驻波10内。在细胞培养悬浮液中,细胞保持在驻波的这个压力节点平面内,节点随着细胞的聚结而增长,最终这些细胞节点簇从引力9中落下。然后将这些沉淀的细胞从培养基中取出,从而允许将澄清的培养基泵出以进行进一步的下游处理。超声波作为分离方法的利用已开始转化为生物学应用,从脂质颗粒和红细胞11的分离到哺乳动物灌注细胞培养12。凭借其通过避免离心、深度过滤或TFF来降低成本、劳动力和细胞应激的相对能力,生物制造商正在探索使用声学分离的潜在应用。
本研究为操作台式声波分离器(AWS)以澄清CHO细胞培养提供了通用方案,提供了代表性数据,并演示了如何实现有效的细胞澄清和产物回收。
描述是一个分步协议,用于实施实验室规模的AWS,以初步澄清来自CHO细胞系HCCF的模型单克隆抗体。如代表性结果所示,在初级澄清中使用 AWS 可有效进行单元澄清和产品回收。此外,低水平的维护和操作要求以及放大生产能力允许在初级澄清中具有更广泛的应用潜力。
重要的是,具有代表性的结果表明,进料泵速率对于细胞的分离至关重要。此外,由于在浊度测量中检测高细胞密度的限制,工作细胞密度是使用 AWS 系统时要考虑的另一个因素。由于在运行高细胞密度进料时浊度探针会饱和,因此最好通过离线测量进料和澄清的细胞培养液的细胞密度来计算细胞分离效率。通过精确的离线澄清测量,在解决这些问题时可以考虑的一种过程策略是串联使用多个腔室。虽然该协议主要侧重于使用单个腔室,但该系统可以操作三个额外的腔室,以便对细胞进行顺序澄清,从而最大限度地减少对细胞状况的影响并导致高产物回收率。此外,其他参数(例如 AWS 的功率和单元去除流速)可以针对特定的单元类型或操作模式进一步优化。总体而言,建议在实施 AWS 之前使用这些注意事项优化操作参数和策略。
在众多应用潜力中,AWS在连续生物处理中的应用前景广阔。因为AWS可以取代离心并大幅减少过滤器表面积14,使用AWS将能够为后续过滤和色谱过程提供恒定的无细胞材料流,与连续生物制造兼容。由于这种兼容性以及灌注技术对高细胞密度(例如,>50 x 106 个细胞/mL)和更长的培养持续时间(例如,>14 天)的可用性,AWS 除了初级澄清之外,还有可能开发出一种新的连续细胞出血策略。
在某些情况下,在稳态操作期间产生的高达30%的蛋白质在细胞出血材料15,16中被除去。此外,要将去除的单克隆抗体与标准收获的材料混合在一起,必须满足某些质量属性。当不符合这些规格时,结果可能是材料被拒收,从而影响产品产量。为了补偿此类产品损失,可以在长期灌注过程中以稳态条件对使用 AWS 的细胞出血材料进行连续澄清17。这种策略可以减少出血材料中的产物损失,并利用更多的蛋白质产生。此外,如果需要更高的细胞密度和生产率,使用AWS进行连续澄清后的细胞可能会被重新添加到生物反应器中。因此,使用 AWS 持续澄清细胞渗漏材料可能会提供在给定过程中提高产量和/或减少二次过滤器表面积的机会。
总而言之,AWS 的实用性不仅限于简单的初级澄清,还可能适用于连续生物工艺中的应用程序,从而提高制造率和运营灵活性。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Nilou Sarah Arden和Zhong Zhao对这份手稿的建设性评论。作者还要感谢Lindsey Brown在这个项目期间提供的重要投入。这项工作的部分内部资金和支持由CDER关键路径计划(CA #1-13)和CDER制造科学,卓越创新中心计划(Berilla-CoE-19-49)提供。该项目部分得到了美国食品和药物管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划的支持,该计划由橡树岭科学与教育研究所通过美国能源部和FDA之间的机构间协议进行管理。
本出版物反映了作者的观点,不应被解释为代表FDA的观点或政策。
Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |