Præsenteret her er en protokol for den primære afklaring af CHO cellekultur ved hjælp af en akustisk separator. Denne protokol kan anvendes til den primære afklaring af rystekolbekulturer eller bioreaktorhøst og har den potentielle anvendelse på kontinuerlig afklaring af celleblødningsmaterialet under perfusion bioreaktoroperationer.
Primær afklaring er et vigtigt skridt i en biofremstillingsproces for den første fjernelse af celler fra terapeutiske produkter inden for den høstede cellekulturvæske. Mens traditionelle metoder som centrifugering eller filtrering er bredt implementeret til cellefjernelse, udstyr til disse processer har store fodspor og drift kan indebære forurening risici og filter begroning. Derudover er traditionelle metoder måske ikke ideelle til kontinuerlige bioprocesordninger til primær afklaring. Således blev en alternativ applikation ved hjælp af akustiske (lyd) bølger undersøgt for kontinuerligt at adskille celler fra cellekulturvæsken. Præsenteret i denne undersøgelse er en detaljeret protokol for brug af en bænk-skala akustisk bølge separator (AWS) for den primære adskillelse af kulturvæske, der indeholder en monoklonal IgG1 antistof fra en CHO celle bioreaktor høst. Repræsentative data præsenteres fra AWS og viser, hvordan man opnår effektiv celleafklaring og produktgendannelse. Endelig drøftes potentielle anvendelser af AWS i kontinuerlig bioproces. Samlet set giver denne undersøgelse en praktisk og generel protokol for gennemførelsen af AWS i primær afklaring for CHO cellekulturer og beskriver yderligere dens anvendelsespotentiale i kontinuerlig bioproces.
Et afgørende skridt i en biofremstillingsproces, der involverer udskillede terapeutiske proteiner, er fjernelse af biomasse fra høstet cellekulturvæske (HCCF). Traditionelt har biomanufacturers vedtaget centrifugering efterfulgt af dybdefiltrering som deres primære afklaringsmetoder i produktionen af monoklonale antistoffer1. Centrifugering kan dog føre til høj forskydningsstress på cellerne, hvilket resulterer i øget cellulær snavs i HCCF. Dette kan potentielt føre til filterbegroning under filtrering og resultere i ekstra forurenende stoffer efterfiltration, der efterfølgende kan reducere downstream kromatografi effektivitet1,2,3. Desuden kan tilpasningen af centrifugerne til en bestemt proces være dyr og kan kræve yderligere forbindelser til rene og sterilisere-in-place-systemer, der også kan være en begrænsende faktor for skalerbarhed. Brugen af dybdefiltre kan kompensere for centrifugationens begrænsninger og også drage fordel af engangsteknologi4. Dybdefiltre bruges dog primært som sekundær afklaring, fordi de ikke kan modstå høje cellekulturtætheder5. Alternativt er der anvendt tangentiel flowfiltrering (TFF) cellefastholdelsesenheder til at afbøde forskydningsstress, men kan opleve udfordringer som membranpolarisering og dårlig høstudbytte6. Ovennævnte spørgsmål som følge af brugen af centrifugering plus dybdefiltrering eller TFF skaber en mulighed for forbedring af HCCF’s primære afklaringsproces.
Akustisk adskillelse blev introduceret som en teknologi, der kan bruges til høst af udskillede proteiner fra cellekulturer med proteinprodukter af høj kvalitet7,8. Akustisk adskillelse opnås gennem formering og afspejling af flerdimensionale stående bølger, der interagerer med suspenderede væsker og bevarede partikler9,10. Disse partikler oplever tre kræfter: væske træk, tyngdekraft, og akustisk stråling. Når hver af kræfterne er lige imod hinanden og når ligevægt, suspenderes partiklerne og fanges i ultralyds stående bølge10. I en cellekultur suspension, celler holdes inden for dette trykknude plan af stående bølger, knuden vokser som celler samles, og i sidste ende disse klynger af cellulære knudepunkter falder fra gravitationskraft9. Disse sedimenterede celler fjernes derefter fra medierne, hvilket gør det muligt at pumpe de afklarede medier ud til yderligere downstream-behandling. Udnyttelsen af ultralydbølger som separationsmetode er begyndt at oversætte til biologiske anvendelser lige fra adskillelse af lipidpartikler og røde blodlegemer11 til pattedyrs perfusionscellekultur12. Med sine relative evner til at reducere omkostninger, arbejdskraft og cellulær stress ved at undgå centrifugering, dybdefiltrering eller TFF udforsker biomanufacturere de potentielle anvendelser af at bruge akustisk adskillelse.
Denne undersøgelse giver en generel protokol for drift af en bordplade akustisk bølge separator (AWS) for afklaring af CHO cellekultur, præsenterer repræsentative data, og viser, hvordan man opnår en effektiv celle afklaring og produkt opsving.
Beskrevet er en trin-for-trin protokol for gennemførelsen af en bænk-skala AWS i primær afklaring af en model monoklonale antistof fra HCCF af en CHO celle linje. Som det fremgår af de repræsentative resultater, resulterede brugen af AWS i primær afklaring i en effektiv celleafklaring og produktgendannelse. Desuden giver det lave niveau af vedligeholdelses- og driftskrav og opskaleringskapacitet mulighed for et bredere anvendelsespotentiale i den primære afklaring.
Det er vigtigt, at de repræsentative resultater tyder på, at foderpumpehastigheden er afgørende for adskillelsen af cellerne. På grund af begrænsninger i detektering af høj celletæthed i turbiditetsmålingen er arbejdscelletæthed desuden en anden faktor at overveje, når du bruger et AWS-system. Da turbiditetssonden vil blive mættet, når der køres fodermateriale med høj celletæthed, kan det være bedst at beregne celleadskillelseseffektiviteten ved at måle celletætheden i fodermaterialet og afklare cellekulturvæske offline. Med nøjagtig offline måling af afklaring er en processtrategi, der kan overvejes i løsningen af disse problemer, at bruge flere kamre i serie. Selvom denne protokol primært er fokuseret på at bruge et enkelt kammer, kan dette system betjene tre ekstra kamre til sekventiel afklaring af cellerne, der minimalt kan påvirke cellernes tilstand og resultere i høj produktgendannelse. Derudover kan andre parametre, såsom strøm til AWS og cellefjernelseshastigheder, optimeres yderligere til bestemte celletyper eller driftsmåde. Samlet set anbefales en optimering af driftsparametrene og strategien ved hjælp af disse overvejelser forud for implementeringen af AWS.
Blandt mange anvendelsespotentialer er brugen af AWS i kontinuerlig bioprocessing lovende. Da AWS kan erstatte centrifugering og drastisk reducere filteroverfladen14, ville brugen af AWS muliggøre en konstant strøm af cellefrit materiale til efterfølgende filtrerings- og kromatografiprocesser, der er kompatible med kontinuerlig biofremstilling. På grund af denne kompatibilitet og tilgængeligheden af perfusionsteknologi til høj celletæthed (f.eks. >50 x 106 celler/mL) og længere kulturvarighed (f.eks. >14 dage) har AWS potentiale til at udvikle en ny kontinuerlig celleblødningsstrategi ud over den primære afklaring.
I nogle tilfælde fjernes op til 30 % af det protein terapeutiske frembragte under stabil drift i celleblødningsmaterialet15,16. For at de fjernede monoklonale antistoffer kan samles med det standardhøstede materiale, skal visse kvalitetsattributter desuden opfyldes. Når disse specifikationer ikke er opfyldt, kan resultatet være en afvisning af materiale, der kan påvirke produktudbyttet. For at kompensere for et sådant produkttab kan en kontinuerlig afklaring af celleblødningsmateriale ved hjælp af AWS implementeres i en stabil tilstand under en langsigtet perfusionsproces17. Denne strategi kan reducere produkttabet i blødematerialet og udnytte mere af det producerede protein. Derudover kan celler efter den kontinuerlige afklaring ved hjælp af AWS potentielt tilføjes tilbage til bioreaktoren, hvis det ønskes for højere celletæthed og produktivitet. Således kan kontinuerlig afklaring af celleblødningsmateriale med AWS give mulighed for at øge udbyttet og/eller reducere sekundært filteroverfladeareal i en given proces.
Sammenfattende er AWS’s nytte ikke begrænset til simpel primær afklaring, men kan have nytteværdi til applikationer i kontinuerlig bioproces, der kan forbedre fremstillingshastigheden og driftsfleksibiliteten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Nilou Sarah Arden og Zhong Zhao for deres konstruktive gennemgang af dette manuskript. Forfatterne vil også gerne takke Lindsey Brown for væsentlige input i løbet af dette projekt. Delvis intern finansiering og støtte til dette arbejde blev leveret af CDER Critical Path Program (CA # 1-13) og CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Dette projekt blev delvist støttet af Internship / Research Participation Program på Office of Biotechnology Products, US Food and Drug Administration, administreres af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en interagency aftale mellem det amerikanske Department of Energy og FDA.
Denne publikation afspejler forfatterens synspunkter og bør ikke fortolkes til at repræsentere FDA’s synspunkter eller politikker.
Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |