النمذجة العمر المرتبطة الأمراض العصبية في Caenorhabditis elegans
Summary
هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع باستخدام بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات ، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية المفرطة التنشيط وتكسية الأعصاب الناتجة عن البروتين ، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للأمراض العصبية المرتبطة بالعمر.
Abstract
أصبحت مكافحة الأمراض العصبية البشرية وإدارة تأثيرها الاجتماعي والاقتصادي المتفشي أولوية عالمية. وعلى الرغم من آثارها الضارة على نوعية حياة الإنسان ونظام الرعاية الصحية، فإن غالبية الاضطرابات العصبية البشرية لا تزال غير قابلة للشفاء ولا يمكن الوقاية منها. ولذلك، فإن تطوير تدخلات علاجية جديدة لمكافحة هذه الأمراض أصبح أمرا ملحا. التدهور المرتبط بالعمر في الدوائر العصبية والوظيفة يتم الحفاظ عليه تطوريا في الكائنات الحية المتنوعة مثل الدودة المنخفضة Caenorhabditis elegans والبشر ، مما يدل على أوجه التشابه في الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية. C. elegans هو نموذج وراثي مرن للغاية، والذي يوفر نظامًا عصبيًا يتميز جيدًا وشفافية الجسم وذخيرة متنوعة من التقنيات الجينية والتصويرية لتقييم نشاط الخلايا العصبية ومراقبة الجودة أثناء الشيخوخة. هنا، نقدم ونصف المنهجيات التي تستخدم بعض نماذج الديدان الخيطية متعددة الاستخدامات، بما في ذلك النخر الناجم عن القناة الأيونية (على سبيل المثال، deg-3(d) و mec-4(d)) وتجميع البروتين (على سبيل المثال، α-syunclein و Poly-glutamate) -الناجم عن السمية العصبية، لرصد وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية للانهيار العصبي المرتبط بالعمر. وسيؤدي الجمع بين هذه النماذج العصبية الحيوانية، إلى جانب الشاشات الوراثية والدوائية لمُعَدِّات موت الخلايا إلى فهم غير مسبوق للانهيار المرتبط بالعمر لوظيفة الخلايا العصبية، وسوف يوفر رؤى حاسمة ذات صلة واسعة بصحة الإنسان ونوعية الحياة.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، وقد استخدمت على نطاق واسع C. elegans ككائن حي نموذجي للتحقيق في الآليات الجزيئية لوفيات الخلايا النخرية. C. elegans يقدم نظام عصبي بشكل استثنائي يتميز بشكل جيد ورسم الخرائط، وهيكل الجسم شفافة وذخيرة متنوعة من الأساليب الوراثية والتصوير لرصد في وظيفة الخلية الجسم الحي والبقاء على قيد الحياة طوال الشيخوخة. وهكذا، تم بالفعل تطوير العديد من النماذج الجينية C. elegans من التنكس العصبي لتقييم صلاحية الخلايا العصبية. على وجه الخصوص، نماذج النيماتودا الموصوفة جيدا والمستخدمة تشمل النخر الناجم عن قناة الأيونات فرط النشاط1،2،3 وموت الخلايا الناجمة عن زيادة تجميع البروتين4،5،6،7،8،9،10 والسكتة الدماغية الحرارة11،12، من بين أمور أخرى.
التعرض على المدى القصير لدرجات حرارة شبه قاتلة منحت المقاومة ضد موت الخلايا النخرية، الناجمة عن الإجهاد الحراري اللاحقة سواء في الديدان الخيطية والخلايا العصبية الثديية11. ومن المثير للاهتمام أن الشرط المسبق اليومي للنيماتودا في درجة حرارة مرتفعة خفيفة يحمي من التنكس العصبي ، والذي تسببه محفزات متنوعة ، مثل عدم التوازن الأيوني (على سبيل المثال ، mec-4 (u231) و / أو deg-3 (u662)) وتجميع البروتين (على سبيل المثال ، α-synuclein و polyQ40)11،13.
هنا، نحن وصف منهجيات متعددة الاستخدامات باستخدام C. elegans لرصد وتقييم التنكس العصبي المعتمد على العمر في النماذج الراسخة من الأمراض البشرية، مثل موت الخلايا الناجمة عن السمية، ومرض باركنسون وهنتنغتون. وعلاوة على ذلك، فإننا نؤكد على الدور العصبي الحماية من الحرارة المسبقة في عدة نماذج من تنكس الأعصاب. وسيؤدي الجمع بين هذه التقنيات والشاشات الوراثية و/أو العقاقيرية إلى تحديد وتوصيف خواص حفّاضات موت الخلايا الجديدة، مع الاهتمام العلاجي المحتمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم ونصف منهجيات يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للنمو ، والتزامن والفحص المجهري لبعض نماذج C. elegans متعددة الاستخدامات التي تحقق في التنكس العصبي المعتمد على العمر. على وجه الخصوص، نحن تقييم وتشريح الأسس الخلوية والجزيئية من العمر المرتبطة انهيار الخلايا العصبية باستخدام فرط ت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تشانيوتاكيس م. وكوناكيس ك. لتسجيل الفيديو وتحريره. يتم تمويل شركة K.P. من منحة من المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار والأمانة العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT). يتم تمويل N.T. من خلال منح من مجلس البحوث الأوروبي (ERC – GA695190 – MANNA) ، وبرامج إطار عمل المفوضية الأوروبية ، ووزارة التعليم اليونانية.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V or deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| DIC microscope (Nomarsky) | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| Epifluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X or mec-4(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintain animals at 20 °C | |
| Microscope slides (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microscope cover glass (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.) | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Tetramisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] | Upon request: G. Caldwell (University of Alabama, Tuscaloosa AL) |
References
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson’s disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
