زرع العظام لأورام الثدي كنماذج ما قبل السريرية لسرطان الثدي
Summary
نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) ونماذج الماوس المعدلة وراثيا القابلة للزراعة تلخص بأمانة الأمراض البشرية وهي نماذج مفضلة لأبحاث سرطان الثدي الأساسية والترجمة. هنا، يتم وصف طريقة لزرع orthotopically شظايا ورم الثدي في لوحة الدهون الثديية لدراسة بيولوجيا الورم وتقييم الاستجابة للأدوية.
Abstract
نماذج ما قبل السريرية التي تلخص بأمانة عدم تجانس الورم والاستجابة العلاجية حاسمة لأبحاث سرطان الثدي المترجمة. خطوط الخلايا الخالدة سهلة النمو والتعديل وراثيا لدراسة الآليات الجزيئية، ومع ذلك فإن الضغط الانتقائي من زراعة الخلايا غالبا ما يؤدي إلى تغييرات وراثية ولاجينية مع مرور الوقت. نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) تلخص بأمانة عدم التجانس والاستجابة الدوائية لأورام الثدي البشرية. نماذج PDX تظهر الكمون قصيرة نسبيا بعد زرع العظام التي تسهل التحقيق في بيولوجيا ورم الثدي والاستجابة للأدوية. تسمح نماذج الماوس المعدلة وراثيا القابلة للزراعة بدراسة مناعة ورم الثدي. يصف البروتوكول الحالي طريقة زرع شظايا ورم الثدي بشكل متعامد في وسادة الدهون الثديية تليها العلاجات الدوائية. توفر هذه النماذج قبل السريرية نهجا قيمة للتحقيق في بيولوجيا ورم الثدي والاستجابة للأدوية واكتشاف العلامات الحيوية وآليات مقاومة الأدوية.
Introduction
يمكن أن تعزى معظم وفيات سرطان الثدي إلى الأمراض المتكررة المقاومة للعلاجات التقليدية1،2. عدم التجانس بين وداخل الورم من سرطان الثدي تسهم في مقاومة العلاج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤثر عدم تجانس الورم على التشخيص الدقيق وتحدي إدارة الأمراض3،4. إن تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية للاستجابة سيحسن بشكل كبير النتائج السريرية للمرضى المصابين بسرطان الثدي. على الرغم من أن معظم أنواع سرطان الثدي هي أورام “باردة” من الناحية المناعية التي من المرجح أن لا تستجيب للعلاج المناعي ، فقد أظهرت مثبطات نقاط التفتيش المناعية وعدا في التجارب السريرية2و5. على سبيل المثال، أظهرت تجربة المرحلة الثالثة تحسن البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض (DFS) والأدلة الأولية على أن atezolizumab (الأجسام المضادة أحادية النسيلة ضد PD-L1) جنبا إلى جنب مع nab-paclitaxel قد توفر فائدة البقاء على قيد الحياة عموما بالمقارنة مع nab-paclitaxel وحدها في الأورام مع ≥1٪ PD-L1تلطيخ 6. تطوير العلاجات التي تتحسس أورام الثدي للعلاج المناعي سوف تحدث ثورة في نظم العلاج.
النماذج قبل السريرية التي تلخص بأمانة عدم التجانس سرطان الثدي البشري والاستجابة للأدوية حاسمة لدراسة بيولوجيا الورم وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة للعلاج المستهدف. وتستخدم خطوط الخلايا الخالدة على نطاق واسع لأبحاث سرطان الثدي لأن هذه الخطوط الخلوية سهلة النمو وتعديلها وراثيا لدراسة الآليات الجزيئية. ومع ذلك، بسبب الضغط الانتقائي من زراعة الخلايا على المدى الطويل في المختبر، قد يحدث الانجراف الوراثي مع مرور الوقت وخطوط خلايا سرطان الثدي قد تحمل التغيرات الجينومية الخاصة بخط الخلية التي تختلف عن الانحرافات في أورام الثدي الأولية7و8و9.
قطع الورم المشتقة من المريض xenograft (PDX) قادرة على تلخيص عدم التجانس في المرض البشري ، وهي مشابهة من الناحية النسيجية والمناعية الكيميائية لورم المنشأ10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22 ،23،24،25،26،27،28،29. الأهم من ذلك، نماذج PDX مستقرة phenotypically عبر عمليات زرع متعددة كما يتضح من الأنسجة، transcriptome، البروتيوم والتحليل الجينومي10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22 ،23،24،25،26،27،28،29. نماذج PDX تظهر استجابات العلاج مماثلة لتلك التي لوحظتسريريا 10،11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22،23،24، 25،26،27،28،29. نماذج PDX لمستقبلات هرمون الاستروجين إيجابية (ER+), مستقبلات البروجسترون إيجابية (العلاقات العامة+), تم إنشاء عامل نمو البشرة 2 إيجابية (ERBB2+, HER2+) وثلاثية سلبية سرطان الثدي (TNBC) نماذج PDX, وتوفير منصة ممتازة لاختبار الغدد الصماء, العلاج الكيميائي- والعلاجات المستهدفة. ومع ذلك ، فإن أحد المحاذير الرئيسية لنماذج PDX في الوقت الحاضر هو عدم وجود جهاز مناعي وظيفي في الماوس.
نماذج الماوس المعدلة وراثيا (GEMM)، مثل Trp53 homozygous null، cMyc، Wnt1، PyMT، أو نماذج التعبير المفرط Her2، تسمح بدراسة بدء الورم التلقائي والتقدم والانبثاث في سياق نظام المناعة السليم. ومع ذلك ، فإن زمن وصول الورم طويل ، مما يجعل من الصعب إجراء تجارب ما قبل السريرية بأذرع متعددة30،31. ومع ذلك، يمكن زرع GEMM إلى المضيفين syngeneic لتوليد أعداد كافية من الأورام التي تلخص عن كثب الأورام البشرية32،33،34،35،36،37،38،39،40 ، 41،42،43،44،45، 46،47،48،49،50،51،52،53،54،55. على سبيل المثال ، تم زرع الظهارة الثديية من فأر BALB / c p53-null في منصات الدهون الخالية من الفئران المتلقية من النوع البري السينغي لتشكيل الأورام الأولية ، والتي يمكن زرعها بشكل أكبر في مضيفي syngeneic56،57. الأورام p53-null خلاصة أنواع فرعية مختلفة من الأورام البشرية.
مزيج من نماذج PDX وGEMM القابلة للزراعة يوفر أدوات قيمة قبل السريرية للتحقيق في بيولوجيا ورم الثدي، والاستجابة للأدوية والمناعة المضادة للورم. في البروتوكول الحالي ، يتم وصف طريقة زراعة العظام لشظايا ورم PDX و GEMM في لوحة الدهون الثديية الماوس. هذه النماذج قابلة للمقاطع التسلسلية وعادة ما تحتفظ بنمط الظاهري مستقرة. للتخفيف من خطر الانجراف الجيني أو فقدان التغايرية عبر الممرات مع مرور الوقت ، يتم تقديم شظايا أنسجة متعددة في كل ممر لزرعها لاحقا في حالة ملاحظة تغييرات بيولوجية أو مورفولوجية بمرور الوقت29،58.
Protocol
Representative Results
Discussion
للحد من الاختلافات في نمو الورم عبر الحيوانات، من المهم قطع أنسجة الورم إلى 1 مم3 شظايا لزرعها. النماذج التي تنمو الأنسجة الرخوة من الصعب العمل مع وشظايا الورم تحتاج إلى قطع أكبر قليلا (1-2 مم3). عند وضع الأنسجة في جيب وسادة الدهون الثديية الحرص على عدم تقسيم الأنسجة إلى قطع متعددة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (R37CA228304 وR01HL146642 إلى شي تشن، CA148761 إلى جيفري م. روزين)، وزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH-19-1-0524 إلى شي تشن، W81XWH-19-1-0035 إلى شيانغدونغ لف)، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-18-181-01-TBE إلى شي تشن) ومعهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (RR150009 CPRIT الباحث في جائزة أبحاث السرطان لشي تشن)، وXenograft المستمدة من المريض والمتقدمة في نماذج فيفو الأساسية في كلية بايلور للطب (التمويل من RP170691 CPRIT جائزة مرفق الأساسية وNCI-CA125123 P30 منحة دعم مركز السرطان).
Materials
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66 (2019).
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
- Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
- Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
- Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
- Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
- Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
- Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
- Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
- Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
- Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
- Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
- Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
- Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
- Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
- Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
- Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
- Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
- Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
- Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
- Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
- Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
- Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
- Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
- Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
- Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
- Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
- Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
- Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
- Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
- Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
- Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
- Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
- Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
- Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
- Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
- Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
- Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
- Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
- Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
- DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).
