Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama
Summary
Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.
Abstract
Los modelos preclínicos que recapitulan fielmente la heterogeneidad tumoral y la respuesta terapéutica son críticos para la investigación traslacional del cáncer de mama. Las líneas celulares inmortalizadas son fáciles de cultivar y modificar genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares, sin embargo, la presión selectiva del cultivo celular a menudo conduce a alteraciones genéticas y epigenéticas con el tiempo. Los modelos de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) recapitulan fielmente la heterogeneidad y la respuesta farmacológica de los tumores de mama humanos. Los modelos PDX exhiben una latencia relativamente corta después del trasplante ortotópico que facilita la investigación de la biología del tumor de mama y la respuesta a los medicamentos. Los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables permiten el estudio de la inmunidad tumoral de mama. El protocolo actual describe el método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria seguido de tratamientos farmacológicos. Estos modelos preclínicos proporcionan enfoques valiosos para investigar la biología del tumor de mama, la respuesta a los medicamentos, el descubrimiento de biomarcadores y los mecanismos de resistencia a los medicamentos.
Introduction
La mayoría de las muertes por cáncer de mama se pueden atribuyer a enfermedades recurrentes que son resistentes a las terapiasconvencionales1,2. La heterogeneidad inter e intratitumoral de los cánceres de mama contribuye a la resistencia a la terapia. Además, la heterogeneidad tumoral puede afectar el pronóstico preciso y desafiar el manejo de la enfermedad3,4. La identificación de biomarcadores predictivos de respuesta mejorará significativamente los resultados clínicos de las pacientes con cáncer de mama. A pesar de que la mayoría de los tipos de cáncer de mama son tumores inmunológicamente “fríos” que probablemente no responden a la inmunoterapia, los inhibidores del punto de control inmunitario han demostrado ser prometedores en ensayos clínicos2,5. Por ejemplo, un ensayo de fase III mostró una mejor supervivencia libre de enfermedad (SSE) y evidencia preliminar de que atezolizumab (anticuerpo monoclonal contra PD-L1) combinado con nab-paclitaxel puede proporcionar un beneficio de supervivencia general en comparación con nab-paclitaxel solo en tumores con tinción de PD-L1 del ≥1%6. El desarrollo de terapias que sensibilizan a los tumores de mama a la inmunoterapia revolucionará los regímenes de tratamiento.
Los modelos preclínicos que recapitulan fielmente la heterogeneidad del cáncer de mama humano y la respuesta farmacológica son fundamentales para estudiar la biología del tumor e identificar posibles biomarcadores para la terapia dirigida. Las líneas celulares inmortalizadas son ampliamente utilizadas para la investigación del cáncer de mama, ya que estas líneas celulares son fáciles de cultivar y modificar genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares. Sin embargo, debido a la presión selectiva del cultivo celular a largo plazo in vitro, la deriva genética puede ocurrir con el tiempo y las líneas celulares de cáncer de mama pueden transportar alteraciones genómicas específicas de la línea celular que son distintas de las aberraciones en los tumores primarios de mama7,8,9.
Los fragmentos tumorales de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) son capaces de recapitular la heterogeneidad de la enfermedad humana y son histológica e inmunohistoquímicamente similares al tumor de origen10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Es importante destacar que los modelos PDX son fenotípicamente estables en múltiples trasplantes, como lo demuestran la histología, el transcriptoma, el proteoma y el análisis genómico10,11,12, 13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Los modelos PDX muestran respuestas al tratamiento comparables a las observadas clínicamente10,11, 12,13,14 , 15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. Se han establecido modelos PDX para receptores de estrógenopositivos(ER +), receptores de progesterona positivos (PR+),factor de crecimiento epidérmico 2 positivo (ERBB2+,HER2+) y cáncer de mama triple negativo (TNBC), y proporcionan una excelente plataforma para probar terapias endocrinas, químicas y dirigidas. Sin embargo, una advertencia principal de los modelos PDX en la actualidad es la falta de un sistema inmunológico funcional en el ratón.
Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM), como los modelos de sobreexpresión homocigota nula Trp53, cMyc, Wnt1, PyMT o Her2, permiten el estudio de la iniciación espontánea del tumor, la progresión y la metástasis en el contexto de un sistema inmune intacto. Sin embargo, la latencia tumoral es larga, lo que dificulta la realización de ensayos preclínicos con múltiples brazos30,31. Sin embargo, GEMM puede ser trasplantado a huéspedes singénicos para generar un número suficiente de tumores que recapitulan estrechamente los tumores humanos32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Por ejemplo, el epitelio mamario de un ratón BALB/c p53-nulo se trasplantó a las almohadillas de grasa despejadas de ratones receptores singénicos de tipo salvaje para formar tumores primarios, que pueden trasplantarse a huéspedes singénicos56,57. Los tumores p53-nulos recapitularon diferentes subtipos de tumores humanos.
La combinación de modelos PDX y GEMM trasplantable proporciona valiosas herramientas preclínicas para investigar la biología del tumor de mama, la respuesta a los medicamentos y la inmunidad antitumoral. En el protocolo actual, se describe un método de trasplante ortotópico de fragmentos tumorales PDX y GEMM en la almohadilla de grasa mamaria de ratón. Estos modelos son susceptibles de pasajes en serie y generalmente conservan un fenotipo estable. Para mitigar el riesgo de deriva genética o pérdida de heterogeneidad a través de pasajes a lo largo del tiempo, se criopreservan múltiples fragmentos de tejido en cada pasaje para su posterior trasplante en el caso de que se observen cambios biológicos o morfológicos a lo largo del tiempo29,58.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para reducir las variaciones en el crecimiento tumoral entre los animales, es fundamental cortar el tejido tumoral en fragmentos de 1 mm3 para el trasplante. Los modelos que crecen tejidos blandos son más difíciles de trabajar y los fragmentos tumorales deben cortarse un poco más grandes (1-2 mm3). Al colocar el tejido en el bolsillo de la almohadilla de grasa mamaria, tenga cuidado de no dividir el tejido en múltiples pedazos, ya que esto dará como resultado múltiples tumores pequeños o tumo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R37CA228304 y R01HL146642 a Xi Chen, CA148761 a Jeffrey M. Rosen), el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH-19-1-0524 a Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 a Xiangdong Lv), la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-18-181-01-TBE a Xi Chen) y el Instituto de Prevención e Investigación del Cáncer de Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award to Xi Chen), el núcleo de xenoinjerto derivado del paciente y modelos avanzados in vivo en Baylor College of Medicine (financiamiento de RP170691 CPRIT Core Facility Award y NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).
Materials
| 1 mg/mL Buprenorphine-SR | ZooPharm (via BCM veterinarians) | Sterile | |
| 26G syringe | BD | 148232E | Sterile |
| Betadine Scrub | Fisher | 19-027132 | |
| Cotton Swabs | VWR International Laboratory | 89031-272 | Sterile |
| DMEM | Fisher | MT 10-013-CM | Sterile |
| Electric shaver | Oster | 78005-050 | |
| Glass beads sterilizer (Germinator) | Roboz Surgical Store | DS-401 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Akorn Animal Health | 17478-062-35 | |
| Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5139 | Sterile |
| Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter) | Roboz Surgical Store | RS-5658BT | Sterile |
| Micro Forceps (tissue placing forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5069 | Sterile |
| Petri Dish | Fisher | 08-757- 100D | Sterile |
| Sterile drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | Sterile |
| Surgery scissors | Roboz Surgical Store | RS-5960 | Sterile |
| Tissue Forceps (claw forceps) | Roboz Surgical Store | RS-5158 | Sterile |
| Wound clip applier | BD Autoclip Wound System | 01-804 | Sterile |
| Wound clip remover | BD Autoclip Wound System | 01-804-15 | Sterile |
| Wound clips | BD Autoclip Wound System | 01-804-5 | Sterile |
References
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66 (2019).
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C. Personalized treatment of early-stage breast cancer: present concepts and future directions. Cancer Treatment Reviews. 36 (8), 584-594 (2010).
- Zardavas, D., Irrthum, A., Swanton, C., Piccart, M. Clinical management of breast cancer heterogeneity. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (7), 381 (2015).
- Esteva, F. J., Hubbard-Lucey, V. M., Tang, J., Pusztai, L. Immunotherapy and targeted therapy combinations in metastatic breast cancer. The Lancet Oncology. 20 (3), e175-e186 (2019).
- Schmid, P., et al. Atezolizumab and nab-paclitaxel in advanced triple-negative breast cancer. New England Journal of Medicine. 379 (22), 2108-2121 (2018).
- Tsuji, K., et al. Breast cancer cell lines carry cell line-specific genomic alterations that are distinct from aberrations in breast cancer tissues: comparison of the CGH profiles between cancer cell lines and primary cancer tissues. BMC Cancer. 10 (1), 15 (2010).
- Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
- Clarke, R. Human breast cancer cell line xenografts as models of breast cancer-the immunobiologies of recipient mice and the characteristics of several tumorigenic cell lines. Breast Cancer Research and Treatment. 39 (1), 69-86 (1996).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514 (2011).
- Kuperwasser, C., et al. Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America of the United States of America. 101 (14), 4966-4971 (2004).
- Vaillant, F., et al. Targeting BCL-2 with the BH3 mimetic ABT-199 in estrogen receptor-positive breast cancer. Cancer Cell. 24 (1), 120-129 (2013).
- Li, S., et al. Endocrine-therapy-resistant ESR1 variants revealed by genomic characterization of breast-cancer-derived xenografts. Cell Reports. 4 (6), 1116-1130 (2013).
- DeRose, Y. S., et al. Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine. Current Protocols in Pharmacology. 60 (1), 14.23.11-14.23.43 (2013).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13 (13), 3989-3998 (2007).
- Zhang, H., et al. Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition. Breast Cancer Research. 16 (2), R36 (2014).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118 (2007).
- Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: Influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. International Journal of Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).
- Sebesteny, A., et al. Primary human breast carcinomas transplantable in the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 63 (6), 1331-1337 (1979).
- Sakakibara, T., et al. Growth and metastasis of surgical specimens of human breast carcinomas in SCID mice. The Cancer Journal from Scientific American. 2 (5), 291-300 (1996).
- Rae-Venter, B., Reid, L. M. Growth of human breast carcinomas in nude mice and subsequent establishment in tissue culture. Cancer Research. 40 (1), 95-100 (1980).
- Outzen, H., Custer, R. Brief communication: Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. Journal of the National Cancer Institute. 55 (6), 1461-1466 (1975).
- Noël, A., et al. Heterotransplantation of primary and established human tumour cells in nude mice. Anticancer Research. 15 (1), 1-7 (1995).
- Naundorf, H., Fichtner, I., Büttner, B., Frege, J. Establishment and characterization of a new human oestradiol-and progesterone-receptor-positive mammary carcinoma serially transplantable in nude mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 119 (1), 35-40 (1992).
- Murthy, M. S., Scanlon, E. F., Jelachich, M. L., Klipstein, S., Goldschmidt, R. A. Growth and metastasis of human breast cancers in athymic nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 13 (1), 3-15 (1995).
- Fichtner, I., Becker, M., Zeisig, R., Sommer, A. In vivo models for endocrine-dependent breast carcinomas: special considerations of clinical relevance. European Journal of Cancer. 40 (6), 845-851 (2004).
- Ding, L., et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft. Nature. 464 (7291), 999 (2010).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73 (15), 4885-4897 (2013).
- Borowsky, A. D. Choosing a mouse model: experimental biology in context-the utility and limitations of mouse models of breast cancer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a009670 (2011).
- Caligiuri, I., Rizzolio, F., Boffo, S., Giordano, A., Toffoli, G. Critical choices for modeling breast cancer in transgenic mouse models. Journal of Cellular Physiology. 227 (8), 2988-2991 (2012).
- Backlund, M. G., et al. Impact of ionizing radiation and genetic background on mammary tumorigenesis in p53-deficient mice. Cancer Research. 61 (17), 6577-6582 (2001).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052-1058 (2000).
- Hüsler, M. R., et al. Lactation-induced WAP-SV40 Tag transgene expression in C57BL/6J mice leads to mammary carcinoma. Transgenic Research. 7 (4), 253-263 (1998).
- Simin, K., et al. pRb inactivation in mammary cells reveals common mechanisms for tumor initiation and progression in divergent epithelia. PLoS Biology. 2 (2), e22 (2004).
- Sandgren, E. P., et al. Inhibition of mammary gland involution is associated with transforming growth factor α but not c-myc-induced tumorigenesis in transgenic mice. Cancer Research. 55 (17), 3915-3927 (1995).
- Gallahan, D., et al. Expression of a truncated Int3 gene in developing secretory mammary epithelium specifically retards lobular differentiation resulting in tumorigenesis. Cancer Research. 56 (8), 1775-1785 (1996).
- Tsukamoto, A. S., Grosschedl, R., Guzman, R. C., Parslow, T., Varmus, H. E. Expression of the int-1 gene in transgenic mice is associated with mammary gland hyperplasia and adenocarcinomas in male and female mice. Cell. 55 (4), 619-625 (1988).
- Guy, C. T., Cardiff, R., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Guy, C. T., et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (22), 10578-10582 (1992).
- Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37 (1999).
- Maroulakou, I. G., Anver, M., Garrett, L., Green, J. E. Prostate and mammary adenocarcinoma in transgenic mice carrying a rat C3 (1) simian virus 40 large tumor antigen fusion gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (23), 11236-11240 (1994).
- Yin, Y., et al. Characterization of medroxyprogesterone and DMBA-induced multilineage mammary tumors by gene expression profiling. Molecular Carcinogenesis. 44 (1), 42-50 (2005).
- Cressman, V. L., et al. Mammary tumor formation in p53-and BRCA1-deficient mice. Cell Growth and Differentiation-Publication American Association for Cancer Research. 10 (1), 1-10 (1999).
- Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
- Pond, A. C., et al. Fibroblast growth factor receptor signaling dramatically accelerates tumorigenesis and enhances oncoprotein translation in the mouse mammary tumor virus-Wnt-1 mouse model of breast cancer. Cancer Research. 70 (12), 4868-4879 (2010).
- Sinn, E., et al. Coexpression of MMTV/v-Ha-ras and MMTV/c-myc genes in transgenic mice: synergistic action of oncogenes in vivo. Cell. 49 (4), 465-475 (1987).
- Muller, W. J., et al. The int-2 gene product acts as an epithelial growth factor in transgenic mice. The EMBO Journal. 9 (3), 907-913 (1990).
- Liu, S., et al. Expression of autotaxin and lysophosphatidic acid receptors increases mammary tumorigenesis, invasion, and metastases. Cancer Cell. 15 (6), 539-550 (2009).
- Torres-Arzayus, M. I., et al. High tumor incidence and activation of the PI3K/AKT pathway in transgenic mice define AIB1 as an oncogene. Cancer Cell. 6 (3), 263-274 (2004).
- Chan, S. R., et al. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas. Breast Cancer Research. 14 (1), R16 (2012).
- Jiang, Z., et al. Rb deletion in mouse mammary progenitors induces luminal-B or basal-like/EMT tumor subtypes depending on p53 status. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3296-3309 (2010).
- Adams, J. R., et al. Cooperation between Pik3ca and p53 mutations in mouse mammary tumor formation. Cancer Research. 71 (7), 2706-2717 (2011).
- Pei, X. H., et al. CDK inhibitor p18INK4c is a downstream target of GATA3 and restrains mammary luminal progenitor cell proliferation and tumorigenesis. Cancer Cell. 15 (5), 389-401 (2009).
- Bultman, S., et al. Characterization of mammary tumors from Brg1 heterozygous mice. Oncogene. 27 (4), 460 (2008).
- Jerry, D., et al. A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development. Oncogene. 19 (8), 1052 (2000).
- Zhang, M., et al. Identification of tumor-initiating cells in a p53-null mouse model of breast cancer. Cancer Research. 68 (12), 4674-4682 (2008).
- Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy. Breast Cancer Research. 15 (1), 201 (2013).
- Zhang, X., Lewis, M. T. Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models of Human Breast Cancer. Current Protocols in Mouse Biology. 3 (1), 21-29 (2013).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of Visualized Experiments. (8), e308 (2007).
- Zhao, N., et al. Pharmacological targeting of MYC-regulated IRE1/XBP1 pathway suppresses MYC-driven breast cancer. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1283-1299 (2018).
- DeOme, K., Faulkin, L., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Research. 19 (5), 515 (1959).
