Måling av avling motilitet og mat passaging i Drosophila

Summary

Målet med denne protokollen er å måle avlingssammentrekning og kvantifisere matdistribusjon i Drosophila tarmen.

Abstract

De fleste dyr bruker mage-tarmkanalen (GI) til å fordøye mat. Bevegelsen av den inntatte maten i GI-kanalen er avgjørende for næringsabsorpsjon. Uorden GI motilitet og gastrisk tømming forårsake flere sykdommer og symptomer. Som en kraftig genetisk modell organisme, Drosophila kan brukes i GI motility forskning. Drosophila-avlingen er et organ som trekker seg sammen og flytter mat inn i midten for videre fordøyelse, funksjonelt lik en pattedyrmage. Presentert er en protokoll for å studere Drosophila avling motilitet ved hjelp av enkle måleverktøy. En metode for å telle avlingssammentrekninger for å evaluere avlingsmotilitet og en metode for å oppdage fordelingen av matfarget blått mellom avlingen og tarmen ved hjelp av et spektrofotometer for å undersøke effekten av avlingen på matpassaging er beskrevet. Metoden ble brukt til å oppdage forskjellen i avlingsmotilitet mellom kontroll og nprl2 muterte fluer. Denne protokollen er både kostnadseffektiv og svært følsom for avlingsmotilitet.

Introduction

De fleste dyr har et fordøyelsesrør kalt mage-tarmkanalen (GI) for å absorbere energi og næringsstoffer fra miljøet. Den menneskelige GI-kanalen består av fire deler: spiserøret, magen, tynntarmen og tykktarmen (kolon). Matpassasje fra magen til tarmen er avgjørende for næringsabsorpsjon. Noen effektorer, som aldring, giftige stoffer og infeksjon, forårsaker uorden GI-kanalmotilitet og gastrisk tømming, som er relatert til noen sykdommer og deres symptomer som dyspepsi, gastroøsofageal reflukssykdom og forstoppelse¹.

Fruktfluen (Drosophila melanogaster) er et mye brukt modelldyr i biomedisinsk forskning på grunn av sin enkle genetiske manipulasjon. Viktigere, ca 77% av gener forbundet med menneskelig sykdom har en homolog i Drosophila². Forskning ved hjelp av Drosophila har gjort enorme fremskritt i vår forståelse av mange sykdomsmekanismer. Som en kraftig genetisk modell organisme, Drosophila er mye brukt i GI tract forskning³. Drosophila har en enklere fordøyelseskanal, som er delt inn i tre diskrete domener: foregut, midgut og hindgut⁴. Avlingen, en del av foredelen, er en poselignende struktur som fungerer som et sted for inntatt matlagring. Midgut er et langt rør og fungerer som stedet for mat fordøyelse og næringsabsorpsjon gjennom epitellaget, som består av absorptive enterocytes (ECs) og sekretoriske enteroendokrine (EE) celler⁵. Interessant, magen funksjonen i Drosophila er delt inn i to deler: avlingen fungerer som mat lagring og kobbercelleregionen (CCR) er en svært sur region med en pH < 3⁶. I Drosophilaflyttes den inntatte maten først til avlingen og deretter pumpes inn i midgut⁷. Dermed spiller avlingen en kritisk rolle i matpassaging. Innhyllet av viscerale muskler og bestående av et komplekst utvalg av ventiler og sphincters, fortsetter avlingen å trekke seg sammen og flytte mat inn i midtgut for videre fordøyelse.

Denne protokollen gjør det mulig for påvisning av matbevegelse fra avlingen til midgut i Drosophila. Crop sammentrekning evalueres ved å telle avling sammentrekning frekvens. I tillegg undersøkes effekten av avlingen på matpassaging ved å oppdage matfordelingen mellom avling og tarm. Videre kan matfordelingen brukes til å reflektere umiddelbar matbevegelse eller grunnleggende matstatus ved hjelp av forskjellige fôringsperioder. Samlet gir denne protokollen metoder for raskt å evaluere avlingsmotilitet og matpassaging i Drosophila.

Protocol

1. Vedlikeholde og forberede eksperimentelle fluer Opprettholde fluer i hetteglass som inneholder 10 ml nylaget mat (1% agar, 2,4% bryggergjær, 3% sukrose, 5% maismel) i en inkubator ved 25 °C med 60% fuktighet. Sett lyssyklusen til inkubatoren til 12-timers lys: 12-timers mørk. For å sikre at et stort antall av de ønskede genotypen flyr eus samtidig, kultur unge fluer (1-3 dager gammel) i standard mat med tørr gjær på overflaten i 3 dager. Overfør de voksne til et nytt mat hetteglass med sta…

Representative Results

Disse metodene for å telle avling sammentrekningshastighet og oppdage farget matdistribusjon kan brukes til å evaluere avlingsfunksjonen på matmotilitet. Avlingssammentrekningen reflekterer hyppigheten av å skyve mat inn i tarmen. Fordelingen av fargestoff i fly etter en kort fôringsperiode indikerer umiddelbar mat som passerer fra avling til midgut. Målet for rapamycin kompleks 1 (TORC1) er en master regulator som medierer næringsstoff og celle metabolisme. TORC1 hemming forlenger leve…

Discussion

I Drosophila inntatt mat beveger seg fra avlingen til tarmen for fordøyelsen. Under denne prosessen absorberes næringsstoffene, og avfallet blir utvist ut av kroppen som avføring. Dermed kan sammenligning av matinntak sammen med avføring utstøting brukes til å grovt vurdere hastigheten på matbevegelse i kroppen. Metoden for kapillærmater (CAFE) er mye brukt til å måle matinntak^10,11. Metoden for avføring nummer telling kan brukes til å estime…

Materials

96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30