Medindo motilidade de cultura e passagem de alimentos em Drosophila

Summary

O objetivo deste protocolo é medir a contração da cultura e quantificar a distribuição de alimentos no intestino de Drosophila.

Abstract

A maioria dos animais usa o trato gastrointestinal (GI) para digerir alimentos. O movimento dos alimentos ingeridos no trato GI é essencial para a absorção de nutrientes. Motilidade desordenada e esvaziamento gástrico causam múltiplas doenças e sintomas. Como um poderoso organismo de modelo genético, o Drosophila pode ser usado em pesquisas de motilidade gi. A cultura Drosophila é um órgão que contrai e move alimentos para o meio para uma digestão mais aprofundada, funcionalmente semelhante a um estômago mamífero. Apresentado é um protocolo para estudar a motilidade da cultura Drosophila utilizando ferramentas de medição simples. Descreve-se um método de contagem de contrações agrícolas para avaliar a motilidade da cultura e um método para detectar a distribuição de alimentos tingidos de azul entre a cultura e o intestino usando um espectrofotômetro para investigar o efeito da cultura na passagem de alimentos. O método foi usado para detectar a diferença na motilidade da cultura entre o controle e as moscas mutantes nprl2. Este protocolo é ao mesmo tempo econômico e altamente sensível à motilidade das culturas.

Introduction

A maioria dos animais tem um tubo digestivo chamado trato gastrointestinal (GI) para absorver energia e nutrientes do ambiente. O trato gi humano é composto de quatro partes: esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso (cólon). A passagem de alimentos do estômago para o intestino é essencial para a absorção de nutrientes. Alguns efeitos, como envelhecimento, drogas tóxicas e infecção, causam motilidade do trato GI desordenado e esvaziamento gástrico, que está relacionado a algumas doenças e seus sintomas como dispepsia, doença do refluxo gastroesofágico e constipação¹.

A mosca-das-frutas (Drosophila melanogaster) é um animal modelo amplamente utilizado em pesquisas biomédicas devido à sua fácil manipulação genética. É importante ressaltar que cerca de 77% dos genes associados à doença humana têm um homólogo em Drosophila². Pesquisas usando Drosophila fizeram enormes avanços em nossa compreensão de muitos mecanismos de doença. Como um poderoso organismo de modelo genético, o Drosophila é amplamente utilizado na pesquisa do trato GI³. A drosophila possui um trato digestivo mais simples, que é dividido em três domínios discretos: foregut, midgut e hindgut⁴. A cultura, uma parte do foregut, é uma estrutura semelhante a uma bolsa que serve como um local para armazenamento de alimentos ingeridos. O midgut é um tubo longo e funciona como local para digestão alimentar e absorção de nutrientes através da camada epitelial, que consiste em enterócitos absortivos (CEs) e células enteroendócrinas secretas (EE)⁵. Curiosamente, a função estomacal em Drosophila é dividida em duas partes: a cultura funciona como armazenamento de alimentos e a região da célula de cobre (CCR) é uma região altamente ácida com pH < 3⁶. Em Drosophila,o alimento ingerido é inicialmente movido para a cultura e posteriormente bombeado para o midgut⁷. Assim, a cultura desempenha um papel fundamental na passagem de alimentos. Envolta por músculos viscerais e consistindo de uma complexa variedade de válvulas e esfíncteres, a cultura continua contraindo e movendo alimentos para o meio para uma digestão adicional.

Este protocolo permite a detecção do movimento alimentar da cultura até o midgut em Drosophila. A contração da cultura é avaliada pela contagem da frequência de contração da cultura. Além disso, o efeito da cultura na passagem de alimentos é investigado pela detecção da distribuição de alimentos entre a cultura e o intestino. Além disso, a distribuição de alimentos pode ser usada para refletir o movimento alimentar imediato ou o status alimentar básico usando diferentes períodos de alimentação. Em conjunto, este protocolo fornece métodos para avaliar rapidamente a motilidade da cultura e a passagem de alimentos em Drosophila.

Protocol

1. Manutenção e preparação de moscas experimentais Mantenha moscas em frascos contendo 10 mL de alimentos recém-feitos (1% de ágar, 2,4% de levedura cervejeira, 3% de sacarose, 5% de farinha de milho) em uma incubadora a 25 °C com 60% de umidade. Coloque o ciclo de luz da incubadora para 12 h de luz:12 h escuro. Para garantir que um grande número do genótipo desejado voe simultaneamente, a cultura de moscas jovens (1-3 dias de idade) em alimentos padrão com levedura seca na superfície por 3…

Representative Results

Esses métodos para contar a taxa de contração da cultura e detectar a distribuição de alimentos tingidos podem ser usados para avaliar a função da cultura na motilidade alimentar. A contração da cultura reflete a frequência de empurrar alimentos para o intestino. A distribuição de corante na mosca após um curto período de alimentação indica passagem imediata de alimentos da cultura para o midgut. Alvo do complexo de rapamicina 1 (TORC1) é um regulador mestre que media o metabo…

Discussion

Em Drosophila ingerido alimentos se move da cultura para o intestino para digestão. Durante esse processo, os nutrientes são absorvidos, e os resíduos são expelidos para fora do corpo como fezes. Assim, comparar a ingestão de alimentos com a ejeção das fezes pode ser usado para avaliar aproximadamente a velocidade do movimento alimentar no corpo. O método de alimentador capilar (CAFE) é amplamente utilizado para medir a ingestão de alimentos^10,11</su…

Materials

96-well plate	Thermo fisher	269620
Brillant Blue FCF	Solarbio	E8500	also called FD&C Blue No. 1
Centrifuge	Thermo fisher	Heraeus Pico 17
Spectrophotometer	Spectra Max	cMax plus
Tweezers	Dumont	11252-30