Нейрональная дифференциация от мыши эмбриональных стволовых клеток in vitro
Summary
Здесь мы установили недорогой и простой в эксплуатации метод, который направляет быструю и эффективную дифференциацию от эмбриональных стволовых клеток к нейронам. Этот метод подходит для популяризации среди лабораторий и может быть полезным инструментом для неврологических исследований.
Abstract
Нейронная дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши (mESCs) является потенциальным инструментом для выяснения ключевых механизмов, участвующих в нейрогенезе и потенциально помощи в регенеративной медицине. Здесь мы создали эффективный и недорогой метод дифференциации нейронов от mESCs invitro, используя стратегию комбинаторного скрининга. В условиях, определенных здесь, 2-дневное формирование эмбрионального тела – 6-дневный протокол индукции ретинойной кислоты позволяет быстро и эффективно дифференцироваться от mESCs в нейронные клетки-предшественники (NPC), о чем говорится в формировании хорошо сложенных и нейритных A2lox и 129 производных, которые являются положительными Nestin. Здоровое состояние эмбриональных тел и точка времени применения ретинойной кислоты (РА), а также концентрации РА имеют решающее значение в этом процессе. В последующей дифференциации от NPC в нейроны, N2B27 среднего II (дополнено Neurobasal среды) может лучше поддерживать долгосрочное обслуживание и созревание нейрональных клеток. Представленный метод является высокоэффективным, недорогим и простым в эксплуатации, и может быть мощным инструментом для нейробиологии и исследований биологии развития.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки (ESCs) плюрипотенты и могут дифференцироваться в нервные клетки-предшественники (NPC), а затем в нейроны при определенныхусловиях 1. ESC основе нейрогенеза обеспечивает лучшую платформу для имитации нейрогенеза, таким образом, выступающей в качестве полезного инструмента для развития биологии исследований и потенциально помощьв регенеративной медицине 2,3. В последние десятилетия, многие стратегии были зарегистрированы для индуцирования эмбрионального нейрогенеза, таких кактрансгенный метод 4, используянебольшие молекулы 5, используя микропрофизнь 3Dматрицы 6, и метод совместнойкультуры 7. Тем не менее, большинство из этих протоколов являются либо состояние ограничено или трудно работать, поэтому они не подходят для использования в большинстве лабораторий.
Чтобы найти простой в эксплуатации и недорогой метод для достижения эффективной нейронной дифференциации от mESCs, стратегия комбинаторного скрининга была использована здесь. Как описано на рисунке 1,весь процесс эмбрионального нейрогенеза был разделен на 2 фазы. Фаза I относится к процессу дифференциации от MESCs в NPC, и фаза II относится к последующей дифференциации от NPC в нейроны. На основе принципов простой работы, низкой стоимости, легкодоступных материалов и высокой эффективности дифференциации, семь протоколов в фазе I и три протокола в фазе II были выбраны на основе традиционной системы монослойной культуры приверженцев или эмбриональной системыформирования тела 8,9. Эффективность дифференциации протоколов в обоих фазах оценивалась с использованием наблюдения за морфологией клеток и анализа иммунофлуоресценции. Объединив наиболее эффективный протокол каждой фазы, мы создали оптимизированный метод нейронной дифференциации от mESCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем исследовании мы создали простой и эффективный метод дифференциации нейронов от mESCs, с низкой стоимостью и легко полученными материалами. В этом методе, 2 дня эмбрионального формирования тела следуют 6 дней индукции РА может эффективно способствовать дифференциации MESCs в NPC (?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 31501099) и среднего возраста и молодежи Департамента образования провинции Хубэй, Китай (No. 20191104). И, мы благодарим профессора Wensheng Deng на университете науки и технологии Wuhan для обеспечивать линии стволовой клетки мыши зародышевые A2lox.
Materials
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 – well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson’s disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
