Neuronal differentiering fra mus embryonale stamceller In vitro

Summary

Her etablerede vi en billig og nem at betjene metode, der dirigerer hurtig og effektiv differentiering fra embryonale stamceller til neuroner. Denne metode er velegnet til popularisering blandt laboratorier og kan være et nyttigt værktøj til neurologisk forskning.

Abstract

Den neurale differentiering af mus embryonale stamceller (MESCs) er et potentielt redskab til at belyse de vigtigste mekanismer, der er involveret i neurogenese og potentielt støtte i regenerativ medicin. Her etablerede vi en effektiv og billig metode til neuronal differentiering fra mESC’er in vitro, ved hjælp af strategien for kombinatorisk screening. Under de betingelser, der er defineret her, tillader den 2-dages embryoide kropsdannelse + 6-dages retinosyreinduktionsprotokol hurtig og effektiv differentiering fra mESC’er til neurale prækursorceller (NPC’er), som det ses ved dannelsen af godt stablet og neuritlignende A2lox og 129 derivater, der er Nestin-positive. Den sunde tilstand af embryoiøse kroppe og det tidspunkt, hvor retinosyre (RA) påføres, samt RA-koncentrationerne er kritiske i processen. I den efterfølgende differentiering fra NPC’ere til neuroner kunne N2B27 medium II (suppleret med Neurobasal medium) bedre understøtte langsigtet vedligeholdelse og modning af neuronale celler. Den præsenterede metode er meget effektiv, billig og nem at betjene, og kan være et kraftfuldt værktøj til neurobiologi og udviklingsbiologisk forskning.

Introduction

Embryonale stamceller (ESC’er) er pluripotente og kan differentiere sig til neurale prækursorceller (NPC’ere) og derefter til neuroner under visse betingelser¹. ESC-baseret neurogenese giver den bedste platform til at efterligne neurogenese og tjener dermed som et nyttigt værktøj til udviklingsbiologiske undersøgelser og potentielt støtte i regenerativ medicin^2,3. I de seneste årtier er mange strategier blevet rapporteret for at fremkalde embryonal neurogenese, såsom den transgene metode⁴, ved hjælp af små molekyler⁵, ved hjælp af en 3D-matrix mikromiljø⁶, og co-kultur teknikken⁷. De fleste af disse protokoller er dog enten begrænset eller svære at betjene, og de er derfor ikke egnede til brug i de fleste laboratorier.

For at finde en nem at betjene og billig metode til at opnå effektiv neural differentiering fra mESC’er blev der brugt en kombinatorisk screeningsstrategi her. Som beskrevet i figur 1blev hele processen med embryonal neurogenese opdelt i 2 faser. Fase I henviser til differentieringsprocessen fra MESC’er til NPC’ere, og fase II vedrører den efterfølgende differentiering fra NPC’er til neuroner. Baseret på principperne om nem betjening, lave omkostninger, let tilgængelige materialer og høj differentieringseffektivitet blev syv protokoller i fase I og tre protokoller i fase II valgt baseret på det traditionelle klæbende monolayerkultursystem eller embryoid kropsdannelsessystem^8,9. Differentieringseffektiviteten af protokoller i begge faser blev evalueret ved hjælp af cellemorfologiobservation og immunfluorescensanalyse. Ved at kombinere den mest effektive protokol i hver fase etablerede vi den optimerede metode til neural differentiering fra MESC’er.

Protocol

1. Mus embryonale stamcellekultur Forbered 0,1% gelatinebelagte cellekulturretter eller tallerkener. Der tilsættes 2 ml steriliseret 0,1% gelatine (0,1% m/v i vand) til 60 mm cellekulturretter. Rock forsigtigt for at sikre jævn belægning af cellekulturretterne. Sæt opvasken i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C og lad belægningen i 1 time. Fjern 0,1% gelatineopløsningen, før du sår cellerne.BEMÆRK: Når gelatinen er fjernet, er det ikke nødvendigt at tørre elle…

Representative Results

2-dages embryoid kropsdannelse + 6-dages RA induktion fungerer bedst på at lede differentieringen af mESC’er i NPC’ere (fase I). For at bestemme den optimale protokol, der bedst fremmer differentieringen af MESC’er i NPC’ere (fase I), blev 7 protokoller testet på både A2lox og 129 mESC ‘er (tabel 1), og differentieringsstatus for hver gruppe blev overvåget ved hjælp af lysmikroskop. Som det fremgår af figur 3A, viste de fleste A2lox- og 129-derivater under “2-dages emb…

Discussion

I denne undersøgelse etablerede vi en enkel og effektiv metode til neuronal differentiering fra mESC’er med lave omkostninger og let opnåede materialer. I denne metode kan 2 dages embryoid kropsdannelse efterfulgt af 6 dages RA induktion effektivt fremme differentieringen af mESC’er i NPC’ere (fase I-protokol 3). For fase II differentiering, N2B27 medium II (fase II-protokol 3) mest effektivt fremkalde differentiering fra NPC’ere i neuroner. For at sikre succes bør der lægges større vægt på flere kritiske trin.</p…

Materials

Anti-Nestin antibody [Rat-401]	Abcam	Ab11306	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	T2200	stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044	stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	stored at -20 °C
Coverslips	NEST	801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy	Olympus	CKX53
Gelatin	Gibco	CM0635B	stored at room temperature
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human	Sigma	L5283	stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI – Aqueous, Fluoroshield	Abcam	ab104139	stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution	Gibco	11140076	stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum	Jackson	005-000-121	stored at -20 °C
Neurobasal Medium	Gibco	21103049	stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish	Corning	3262
Phosphate Buffered Saline (1X)	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	stored at -20 °C
Retinoic acid	Sigma	R2625	stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells	Cyagen	MUAES-01001	Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free)	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution	HyClone	SH30042.01	stored at 4 °C
Triton X-100	Sigma	T8787
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023	stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
6 – well plate	Corning	3516
60 mm cell culture dish	Corning	430166
15 ml centrifuge tube	NUNC	339650