Denne protokol tillader differentiering af humane pluripotente celler i intestinale organoider. Protokollen efterligner normal menneskelig udvikling ved at differentiere celler til en population af endelig endoderm, hindgut endoderm og derefter tarmepitel. Dette gør protokollen velegnet til at studere både tarmudvikling såvel som sygdomsmodelleringsapplikationer.
hiPSC-afledte tarmorganoider er epitelstrukturer, der selv samler sig fra differentierede celler til komplekse 3D-strukturer, der er repræsentative for det humane tarmepitel, hvor de udviser krypt / villus-lignende strukturer. Her beskriver vi dannelsen af hiPSC-afledte tarmorganoider ved trinvis differentiering af hiPSC’er til endelig endoderm, som derefter posterioriseres til dannelse af bagtarmepitel, inden de overføres til 3D-kulturbetingelser. 3D-kulturmiljøet består af ekstracellulær matrix (ECM) (f.eks. Matrigel eller anden kompatibel ECM) suppleret med SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 og CHIR99021. Organoider gennemgår passage hver 7. dag, hvor de mekanisk forstyrres før overførsel til frisk ekstracellulær matrix og får lov til at ekspandere. QPCR og immuncytokemi bekræfter, at hiPSC-afledte intestinale organoider indeholder modne intestinale epitelcelletyper, herunder bægerceller, Paneth-celler og enterocytter. Derudover viser organoider tegn på polarisering ved ekspression af villin lokaliseret på den apikale overflade af epitelceller.
De resulterende organoider kan bruges til at modellere menneskelig tarmudvikling såvel som talrige humane tarmsygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom. For at modellere tarmbetændelse kan organoider udsættes for inflammatoriske mediatorer såsom TNF-α, TGF-β og bakteriel LPS. Organoider udsat for proinflammatoriske cytokiner viser en inflammatorisk og fibrotisk fænotype som reaktion. Parring af raske versus hiPSC’er afledt af patienter med IBD kan være nyttig til forståelse af mekanismer, der driver IBD. Dette kan afsløre nye terapeutiske mål og nye biomarkører for at hjælpe med tidlig sygdomsdiagnose.
Egenskaberne af pluripotente stamceller (PSC’er), såsom selvfornyelse og evnen til at differentiere sig til enhver celletype i menneskekroppen, gør dem til værdifulde værktøjer i studiet af udvikling, sygdomspatologi og lægemiddeltest1. Human inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er særligt nyttige til sygdomsmodelleringsundersøgelser, da de kan udledes af patienter og direkte indfange genomet, der er ansvarlig for sygdomsfænotype 2,3. Sådanne hiPSC’er kan differentieres til den celletype, der er påvirket af den genetiske defekt, hvilket muliggør omhyggelig undersøgelse af sygdommens molekylære mekanisme4.
Differentieringsprotokoller for humane PSC’er sigter mod at styre differentiering af celler via de vigtigste udviklingsstadier ved aktivering eller hæmning af specifikke signalveje, der styrer afstamningsforpligtelse og specifikation. Vedligeholdelse af hiPSC i en pluripotent tilstand kræver moderate niveauer af Activin A (Act-A) signalering, mens en høj dosis Act-A i 3 dage forpligter hiPSC til en endelig endoderm (DE) skæbne 5,6. Act-A og Wnt pathways direkte anterior-posterior identitet af DE. Signalering ved Act-A inducerer foregut (FG) markører såsom HHEX, HNF4α og GATA4, mens blokering af ekspression af baggut (HG) gener såsom CDX2. Wnt-signalering inducerer posteriorisering af DE, som derefter vedtager en HG-genekspressionsprofil 7,8. Når HG-celleidentitet er etableret, kan differentiering flyttes fra 2D til 3D og rettes mod dannelsen af tarmorganoider.
Intestinale organoider dyrkes typisk i en 3D ekstracellulær matrix (fx Matrigel eller andre kompatible ECM’er) baseret kultursystem9, der består af laminin, kollagen IV og entactin og beriget med vækstfaktorer som EGF, FGF, PDGF og IGF-1 for at bidrage til støtte overlevelse og spredning. Organoiderne dyrkes i et defineret medium indeholdende Gastrin, Noggin og CHIR for at stimulere og understøtte tarmstamcellevækst og proliferation under langvarig kultur.
Efter at intestinale epitelceller er indlejret i den ekstracellulære matrix, begynder intestinale krypter at danne og ekspandere til sidst og danne sfæroider. Disse modnes til organoide strukturer, der efterligner fysiologisk funktion af tarmepitelet. Organoider kan typisk dyrkes i mere end 1 år uden signifikant tab af funktionelle og genekspressionsprofiler. Passaging er påkrævet på ugentlig basis ved hjælp af enzymatisk fordøjelse af organoiderne i mindre fragmenter, som derefter selvsamler til komplette organoider.
Etablerede organoide linjer kan bruges som en pålidelig model af talrige lidelser forbundet med tarmen, herunder Crohns sygdom, ulcerøs colitis og kolorektal cancer 10,11,12,13. Dette er en foretrukken model for dyreceller, da de udtrykker menneskelige gener, der er forbundet med disse lidelser, og reagerer på eksterne stimuli, der ligner det, der forekommer i humant væv in vivo.
Her beskriver vi en protokol til differentiering af humane pluripotente celler i humane tarmorganoider. Vi demonstrerer deres anvendelse til at studere betændelse; Dette kan dog anvendes i forskellige sammenhænge og kombineret med CRISPR/Cas9 genredigeringsmetoder14 på enhver genetisk baggrund. Når de er differentieret, efter den naturlige udviklingsdifferentieringssekvens af endelig endoderm, baggutendoderm og derefter tarmepitel, kan de resulterende organoider kontinuerligt dyrkes og passeres i mere end 12 måneder.
Et kritisk aspekt af denne protokol er den indledende pletteringstæthed af udifferentierede stamceller før endodermdifferentiering. Hvis dette ikke optimeres tilstrækkeligt, vil celler sandsynligvis dø under det indledende DE-differentieringstrin (hvis cellerne er for sparsomme) eller reducere effektiviteten af DE-differentieringen (hvis cellerne er for tætte). Den korrekte starttæthed skal optimeres for den cellelinje, der bruges, og den korrekte tæthed skal generere et monolag ved slutningen af DE D3. Flowcytometri skal bruges til at bestemme effektiviteten af DE-specifikationen, og vi ser typisk >80% af cellerne positive for SOX17 og / eller CXCR4. Når antallet af SOX17-positive celler er mindre end 60%, påvirkes effektiviteten af HG-mønster, hvilket resulterer i, at der dannes færre organoider, når de overføres til den ekstracellulære matrix. Dette vil i sidste ende få de resulterende organoidkulturer til at mislykkes. For at afgøre, om mønster af DE til HG har været vellykket, vurderer vi antallet af CDX2-positive celler ved flowcytometri og forventer typisk at se >80% positive celler. Igen, hvis antallet af CDX2-positive celler falder til under 50%, vil dette have en negativ indvirkning på antallet af intestinale organoider, der genereres, når de overføres til 3D ekstracellulær matrixkultur.
Efter overførsel af 2D-monolag til 3D-kultur skal små kompakte kugler vises 24-48 timer efter overførsel. Store ark døde celler kan vises afhængigt af differentieringseffektiviteten for den anvendte cellelinje. I stedet for straks at passere kulturer for at fjerne disse affald, tillader vi organoiderne fuldt ud at danne og udvikle deres mere komplekse, foldede struktur. At vente 7-10 dage, før du forsøger den første passage, sikrer, at der er tilstrækkelige delende celler til stede til at generere mange nye tarmorganoider. Ethvert affald, der stadig er til stede i kulturen, kan let fjernes under passageprocessen ved langsomt at dreje de dissocierede organoid/snavsblandinger i et rør med tilstrækkelig hastighed til at pelletere organoiderne, men lade ark af celler flyde i medierne. Medier og cellulært affald kan derefter suges, så kun pellet af organoider forbliver.
Begrænsningen ved denne tilgang er, at hiPSC-afledte celletyper ofte ikke er fuldt modne med hensyn til genekspression og funktionelle profiler. For at afgøre, om hiPSC-afledt tarmvæv er egnet til specifikke anvendelser, skal organoiderne karakteriseres for forskellige celletyper, herunder enterocytter (VIL), enteroendokrine celler (neurog3), bægerceller (MUC2), forbigående amplificerende celler (CD133), panethceller (FZD5) og LGR5+ stamceller (LGR5) for at bestemme den organoide cellulære sammensætning.
Samlet set er den største fordel ved denne protokol i forhold til mange andre organoiddifferentieringsprotokoller, at denne kulturplatform er meget omkostningseffektiv på grund af udskiftning af flere rekombinante proteiner og konditionerede mediepræparater med små molekyler15,16. Differentieringen i HG er meget enkel og hurtig og kan anvendes på både humane embryonale og inducerede pluripotente stamceller med identiske resultater. Når det følges nøje og optimeres til de cellelinjer, der bruges, giver det en relativt enkel modelplatform fri for forurenende mesenkymale celler, som derefter kan anvendes til at studere tarmepitel i en række sammenhænge, herunder inflammation, værtspatogeninteraktioner7. Intestinal fibrose modellering kunne undersøges ved at tilvejebringe pro-fibrotiske stimuli og derefter vurdere ekspression af ekstracellulære matrixproteiner såsom kollagen, laminin og fibronectin ved QPCR, western blot og ELISA. Brug af CRISPR/Cas9-genredigeringsteknikker på udifferentierede stamcellelinjer før differentiering giver mulighed for oprettelse af genknockout- eller proteinoverekspressionsorganoider, der kan bruges til at skabe sygdomsspecifikke organoider og mere komplekse sygdomsmodeller 14,17,18.
The authors have nothing to disclose.
NH finansieres af MRC (MR / S009930 / 1) og Wellcome Trust (204267 / Z / 16 / Z), PD finansieres af MRC PhD DTP, KLF finansieres af BBSRC iCASE.
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Activin A | R&D | 338-AC | |
Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
SB202190 | Tocris | 1264 | |
TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
Wnt 3a | R&D | 5036-WN |