Summary
Detta dokument rapporterar att tillägg av Y-27632 till TIVA medium kan avsevärt öka avkastningen av melanocyter från vuxna hudvävnader.
Abstract
Isolering och kultur av primära melanocyter från hudvävnader är mycket viktigt för biologisk forskning och har använts i stor utsträckning för kliniska tillämpningar. Isolera primära melanocyter från hudvävnader med den konventionella metoden tar vanligtvis ca 3 till 4 veckor att passera tillräckligt. Ännu viktigare, de vävnader som används är oftast nyfödda förhud och det är fortfarande en utmaning att effektivt isolera primära melanocyter från vuxna vävnader. Vi har nyligen utvecklat en ny isoleringsmetod för melanocyter som lägger till Y-27632, en Rho kinashämmare, till det ursprungliga odlingsmediet för 48 h. Jämfört med det konventionella protokollet ökar denna nya metod dramatiskt avkastningen av melanocyter och förkortar den tid som krävs för att isolera melanocyter från förhudsvävnader. Vi beskriver nu denna nya metod mer i detalj med hjälp av vuxna epidermis att effektivt kultur primära melanocyter. Viktigt är att vi visar att melanocyter som erhållits från vuxna vävnader som utarbetats av denna nya metod kan fungera normalt. Detta nya protokoll kommer avsevärt att gynna studier av pigmentering defekter och melanom med hjälp av primära melanocyter som utarbetats från lättillgängliga vuxna hudvävnader.
Introduction
Målet med denna studie var att utveckla ett enkelt och effektivt protokoll för att isolera melanocyter från epidermis av vuxen hud för biologisk forskning och kliniska tillämpningar. Melanocyter, som ligger i den basala epidermis av huden och i hårsäckarna, spelar en viktig roll i pigmentering av hud och hår genom att producera melanin1. Den resulterande hudpigmentering från epidermal melanocyter fungerar som en ultraviolett strålning filter som minskar / förhindrar DNA-skador på underliggande celler i huden2. Den onormala spridningen av melanocyter i huden är ganska vanligt, såsom i bildandet av godartade nevi (mol) där melanocyter potentiellt förvandlas till onkogen tillväxt följt av cellulär senescens3.
Sedan 1957 har isolering och efterföljande kultur av mänskliga primära melanocyter varit möjligt4, men först sedan 1982 har det funnits en effektiv metod som reproducerbart kan etablera kulturer av mänskliga melanocyter från epidermis5. Den konventionella metoden för att isolera primära melanocyter från epidermis innebär en två steg enzymatisk matsmältning. Kortfattat är huden först smält med dispase att skilja epidermis från dermis, varefter epidermis rötas med trypsin att producera suspensioner som innehåller melanocyter och keratinocyter, som sedan kan selektivt odlas i olika medier. För närvarande tar den ursprungliga kulturen vanligtvis ca 3 till 4 veckor för melanocyter att nå sammanflödet med den konventionella metoden, vilket sannolikt beror på den låga effektiviteten i deras isolering. Därför skulle öka den ursprungliga produktionen av melanocyter från vuxna hudvävnader vara till stor hjälp för både laboratorieforskning och kliniska tillämpningar.
Många tillväxtfaktorer, varav de flesta har visat sig utsöndras av keratinocyter (t.ex. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF och SCF)5-8, reglerar differentiering och spridning av däggdjur melanocyter. I avsaknad av matarlager leder bristen på dessa tillväxtfaktorer till den minskade spridningen av melanocyter och deras ökade apoptos9. Samodlingen av keratinocyter som matarceller och melanocyter kan leda till accelererad melanocyte spridning och minskad apoptos. Men samkulturmetoden kräver inte bara fler hudvävnader för att förbereda keratinocyter, vilket inte är praktiskt, men också inte kunde fungera effektivt eftersom de kulturförhållanden som krävs av melanocyter inte gynnar keratinocyttillväxt, och vice versa.
Tidigare studier har rapporterat att tillägg av Y-27632, en ROCK-hämmare, i tillväxtmediet kan öka avkastningen av mänskliga primära epidermala celler från hudvävnader10-14. Därför skulle det vara intressant att testa om isoleringen av mänskliga primära melanocyter skulle dra nytta av förekomsten av Y-27632. Faktum är att tillägg av Y-27632 i inokulering TIVA medium15, som innehåller TPA, IBMX, Na3VO4 och dbcAMP, avsevärt ökat avkastningen av primära melanocyter isolerade från förhud vävnader i de ursprungliga kulturerna16. Jämfört med det konventionella protokollet är detta nya protokoll betydligt effektivare när det gäller att öka avkastningen av melanocyter16. Därför beskriver detta protokoll den nya metoden i detalj med hjälp av vuxna hudvävnader baserade på en tidigare studie16 för att främja dess tillämpning i grundläggande och tillämpad biologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av vävnader från för vuxna i detta protokoll har godkänts av kommittén för humanforskningsetik (nr 2015120401, datum: 12 maj 2015).
OBS: Utför alla följande procedurer i en steril miljö för att förhindra kontaminering av celler och kulturer.
1. Förberedelser
- Samla färska vuxna förhudsvävnader från omskärelseoperationer i 15 ml-rör som innehåller 10 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS) och förvara i 4 °C.
OBS: Separera vävnaderna enligt nedan inom 24 timmar efter deras excision. - Förbered reagenser och odlingsmedium.
- Förbered 3% P/S (penicillin/streptomycin) som tvättlösning. Blanda 50 ml PBS med 1,5 ml penicillin (100 U/ml) och streptomycin (100 mg/L) (P/S).
- Förbered avslutningslösningen (neutraliseringslösning) för neutralisering av enzymatisk matsmältning. Tillägg 1% P/S, 10% fetala bovin serum (FBS) i DMEM medium.
- Förbered TIVA medium för att odla melanocyter: Hams F12; 10% FBS; 1x P/S-glutamin; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-metyl xanthine (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-cykliska monofosfat (dbcAMP).
2.
- Förbehandling av hudvävnad
- Skölj varje vuxen förhudsvävnad en gång med 10 ml 75% etanol (alkohol) i 30 s, och skölj sedan två gånger med 10 ml tvättlösning (3% P/S), i 5 min vardera.
OBS: Tvätta förhudsvävnader med 10 ml PBS i början om det finns mycket blod. Alla tvättar tillagas i 100 mm cellodlingsrätter. - Skrapa varje förhudsvävnad med ett kirurgiskt blad för att avlägsna subkutan fettvävnader och lösa bindväv i locket på en 100 mm cellkulturskål.
OBS: Använd en skalpell för att skrapa bort fettlagren tills endast den tunna epidermis och den täta dermis kvar. - Överför varje vuxen förhud till en annan 100 mm odlingsskål med dermissidan nedåt.
OBS: Skär varje vuxen förhudsvävnad i 3-4 mm breda remsor med hjälp av ett skalpelelblad för att få dispasen att fungera mer effektivt. - Tillsätt 2,5 mg/ml dispase till varje 100 mm odlingsskål med vuxna framhudsvävnader och inkubera i 16 till 20 timmar vid 4 °C.
OBS: Varje gram vävnad rötas med 10 ml dispase lösning.
- Skölj varje vuxen förhudsvävnad en gång med 10 ml 75% etanol (alkohol) i 30 s, och skölj sedan två gånger med 10 ml tvättlösning (3% P/S), i 5 min vardera.
- Separation av epidermis från den vuxna förhuden vävnad
- Efter matsmältningen för 16 till 20 h, separera epidermis från dermis med pincett. Ta tag i ena sidan av huden kanten av vävnaden med en pincett och motsvarande position epidermal del med en annan pincett och försiktigt skala av epidermis.
- Tvätta epidermis 3x med tvättlösning (3% P/S) och överför sedan epidermis till ett rör.
- Doppa epidermis genom att tillsätta 5 ml 0,05% trypsin i röret och inkubera i ett vattenbad i 30 min vid 37 °C.
OBS: Skaka röret för att säkerställa att epidermis är helt nedsänkt före inkubation.
- Insamling och odling av primära celler
- Tillsätt en lika stor volym av avslutningslösning (10% FBS, 1% P/S i DMEM) för att neutralisera trypsin och pipett lösningen upp och ner 10-15 gånger för att separera epidermala celler.
- För cellfjädringen till ett nytt 50 ml-rör genom ett 100 μm nätfilter för att avlägsna skräp.
- Centrifug på 200 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 10 ml inokulering TIVA medium för att återanvända cellerna.
- Sådd de återsuspenderade cellerna i en 100 mm odlingsskål.
- Kultur i en 37° C inkubator med 5% CO2.
- Byt medium varannan dag.
- Passageceller när de når 80% sammanflödet.
3.
OBS: Förfarandet för vävnadsberedning och matsmältning i den nya metoden är detsamma som beskrivits ovan för den konventionella metoden, den enda skillnaden är att de isolerade färska cellerna återanvänds i 10 ml TIVA-medium som innehåller 10 μM Y-27632.
- Två dagar efter sådd, ersätta mediet med normalt TIVA medium utan Y-27632. Därefter är kulturförhållandena desamma mellan de nya och konventionella metoderna.
4. Cell passaging
- Ta bort TIVA-mediet och skölj varje odlingsskål två gånger med PBS.
- Tillsätt 2 ml 0,05% trypsin per 100 mm cellodlingsskål.
OBS: Skaka skålen för att säkerställa tillräcklig kontakt mellan matsmältningsenzymer och botten av skålen. - Smält i en 37 °C inkubator i 2 min.
- Använd ett mikroskop för att kontrollera cellerna och se till att de flesta celler har separerat från cellodlingsskålen.
OBS: Knacka försiktigt på skålen för att frigöra cellerna för att runda upp och flyta i lösningen. Förlänga matsmältningstiden om de flesta celler inte suspenderades efter att ha knackat, men inte mer än 5 minuter. - Överför melanocyterna till ett 15 ml-rör efter att trypsinaktiviteten neutraliserats genom att lägga till 2 ml avslutningslösning. Centrifug på 200 x g i 5 min.
- Resuspend varje cell pellet med 10 ml TIVA medium efter långsamt ta bort supernatant, och sedan räkna antalet melanocyter.
- Platta ca 1 x 106 melanocyter i 10 ml TIVA medium per 100 mm cell kultur skålen.
- Förnya cellodlingsmediet var 48:e timme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett schema som jämför de konventionella och de nya metoderna. Förfarandet för vävnadsberedning och matsmältning med den nya metoden är detsamma som förfarandet för den konventionella metoden, den enda skillnaden är att de isolerade cellerna återanvänds i 10 ml TIVA-medium i närvaro av 10 μM Y-27632. Två dagar efter sådd, ersätta mediet med normalt TIVA medium utan Y-27632. Den konventionella metoden för att isolera primära melanocyter från hudvävnader kräver vanligtvis ca 3 till 4 veckor för melanocyter att växa i tillräckligt många för att passera, men ännu viktigare, vävnaderna kommer vanligtvis från nyfödda barn och det är mycket svårt att isolera primära melanocyter från vuxna hudvävnader. Men med den nya metoden observeras melanocyter från vuxna vävnader i betydligt större antal än melanocyter isolerade med den konventionella metoden. Mikroskopiska vyer togs vid dagarna 3, 6 och 8 när man isolerade melanocyterna från vuxen hudvävnad med den konventionella metoden och den nya metoden (figur 2A). I dessa mikroskopiska vyer ökade den nya metoden signifikant avkastningen av melanocyter vid dag 6 och 8. Melanocyter nummer kvantifierades sedan genom att räkna minst 10 olika mikroskopiska fält vid dag 3, 6 och 8. Resultaten visade att antalet melanocyter som isolerats med den nya metoden är mycket högre än antalet melanocyter som isolerats med den konventionella metoden vid dag 6 och 8 (figur 2B). Efter 8 dagars kultur skördades melanocyterna med trypsin och räknades sedan med en automatiserad cellräknare i varje 100 mm-maträtt, vilket visade att den nya metoden ökade melanocytutbytet med ungefär fem gånger (figur 2C). Mikroskopiska vyer tagna på dag 9, en dag efter passering, visade att de passagede melanocyter förökade sig normalt (figur 2D), som bekräftades av Ki67 färgning (Figur 2E).
Den ökade avkastningen av melanocyter av Y-27632 under den första kulturen efter isolering har visats genom reglering av keratinocyter i en tidigare publikation16. Som visas i figur 3ökade Y-27632 inte tillväxten och spridningen av passaged melanocyter (figur 3A-B) och hämmade inte melanocyternas apoptos (figur 3C-D). Y-27632 ökade dock avsevärt keratinocyttillsatsen (figur 3E-H) och främjade också dess överlevande (figur 3I) i melanocyte-kulturen TIVA media. Antingen samodling med keratinocyter i närvaro av Y-27632 eller det konditionerade mediet som härrör från Y-27632 behandlade keratinocyter kan avsevärt öka tillväxten av melanocyter (figur 3J).
För att ytterligare karakterisera melanocyter isolerade med den nya metoden, MITF, en specifik melanocyt markör, analyserades med hjälp av immunofluorescens (IF) färgning för att kontrollera renhet melanocyter efter första passaging. Figur 4A visar att andelen celler som uttrycker MITF vid passage 1 var nästan 100%, vilket tyder på att rena melanocyter erhölls efter den första passagen med den nya metoden, som liknar den konventionella metoden. För att testa om melanocyter isolerade med den nya metoden kan fungera normalt, behandlades de med forskolin (FSK) i 2 dagar in vitro, vilket inducerade nivåerna av pigmentering av melanocyter (figur 4B). Sammantaget tyder dessa data på att de melanocyter som isolerats med den nya metoden kan fungera normalt och kan producera pigment.
Figur 1: Jämförelse av den nya metoden och den konventionella metoden. Detta schema visar en jämförelse mellan den konventionella metoden och den nya isoleringsmetoden. Den enda skillnaden är att de isolerade färska cellerna återanvänds i 10 ml TIVA-medium i närvaro av 10 μM Y-27632. Två dagar efter sådd ersätts mediet med normalt TIVA-medium utan Y-27632. Den nya metoden uppnår vanligtvis en densitet av melanocyter som lämpar sig för passaging runt dag 8, medan den konventionella metoden vanligtvis tar ca 20 dagar att växa tillräckligt många melanocyter för passaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Den nya isoleringsmetoden ökar produktionen av primära melanocyter. (A)Representativa bilder av melanocyter som framställts med den konventionella metoden (översta raden) och med den nya metoden (nedre raden) vid dag 3, 6 och 8 efter den första inokuleringen. B)Kvantifiering av melanocytnummer som utarbetats med konventionell metod och den nya metoden genom att räkna melanocytnummer i minst 10 olika mikroskopiska fält (cellnummer/syn) vid dag 3, 6 och 8. Alla experiment utfördes i tre exemplar och resultaten uttrycks som det genomsnittliga antalet celler per mikroskopiskt fält. (C)Efter odling i 8 dagar skördades melanocyter med trypsin och antalet melanocyter som utarbetats med den konventionella metoden och den nya metoden räknades med hjälp av en cellräkningsplatta. Antalet celler beräknades från trearbetslica experiment, och resultaten visar det genomsnittliga antalet celler per 100 mm maträtt. (D)Efter att ha räknat antalet melanocyter med hjälp av en automatiserad cellräknare, melanocyter beredda med den konventionella metoden eller den nya metoden såddes i nya rätter och mikroskopiska bilder togs på dag 9. E)Melanocyter som isolerades med den nya metoden vid passage 0 eller vid passage 1 var fixerade och färgade med Ki67-antikroppar (röd) och DAPI (atomkärnor, blå). (B-C), Student's t-testanvändes för att analysera skillnader mellan den nya och den konventionella metoden, ** P < 0,01, ***P < 0,005. Alla skalfält representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Y-27632 förbättrar melanocyttillväxt genom reglering av keratinocyter. ( A) Rena melanocyter (passage 3) behandlades med 10 μM Y-27632 för 12, 24, 48 och 60 h och antalet melanocyter analyserades av CCK-8 analys. B)Rena melanocyter (passage 3) behandlades med 10 μM Y-27632 för 48h och fastställdes sedan för Ki67-färgning. Kvantifiering av procent av Ki67 positiva celler bland totala levande celler som anges med DAPI nukleär färgning. (C-D) Rena melanocyter (passage 3) behandlades med 10 μM Y-27632 för 48 timmar och var sedan antingen färgade för apoptotiska celler med Annexin V-FITC och propidium jodid följt av FACS-analys(C)eller fast för TUNEL-analys. (E) Isolerade epidermis efter trypsin matsmältningen var pläterad med TIVA medium med eller utan Y-27632 (10 μM) och 2 dagar senare immunofluorescens analys av keratinocyter utfördes med en pan-cytokeratin antikroppar (pan-ck). F)Kvantifiering av keratinocyter i de Y-27632-behandlade och kontrollrätter från(E) i procent av keratinocyter i totalt 500 celler räknade. G)Ren passage 3 keratinocyter såddes i TIVA-medium med eller utan Y-27632 (10 μM). Bilder av epidermala celler visas på en dag efter sådd. H)Kvantifiering av bifogade keratinocyter i de Y-27632-behandlade och kontrollrätter från (G) som procentandelen bifogade celler i totalt 5000 sådd celler. (I)Ren passage 3 keratinocyter var pläterade med TIVA medium i närvaro eller avsaknad av Y-27632. Mikroskopiska bilder erhölls vid 24 h.(J)Vänster panel: Lika antal ren passage 3 melanocyter var pläterade med TIVA medium i 4 grupper med tillägg (er) som anges: 1) Y-27632 (10 0 μM) ensam (Y i graf), 2) passage 3 keratinocyter ensam, 3) keratinocyter och Y-27632 (10 μM) (K+Y) och 4) inget tillsats (negativ kontroll, con). Relativa vik förändringar i melanocyte spridning jämfört med den negativa kontrollen fastställdes genom att räkna antalet melanocyter vid 24 h och 48 h efter plätering. Höger panel: Konditionerade TIVA media erhölls från 4 grupper av passage 3 melanocyte kulturer i (vänster panel) på 48 h efter plätering. Sedan var lika många passage 3 melanocyter pläterade i 4 grupper, var och en med en av de konditionerade media. Relativa vik förändringar i melanocyte spridning jämfört med den negativa kontrollen fastställdes genom att räkna antalet melanocyter vid 24 h och 48 h efter plätering. (A-J) Alla experiment har upprepats i 3 gånger, *p<0,05, **p<0.01, ***p<0.005. Alla staplar i bilderna representerar 100 μm. Siffran har ändrats från Mi et al.16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Karakterisering av melanocyter isolerade med den nya metoden. (A)Representativa bilder av immunofluorescensfärgning av MITF (röd) i melanocyter som framställts med den nya eller konventionella metoden. DAPI fläckar kärnor (blå). B)Cellpellets samlades in från melanocyter som beretts med den nya metoden och behandlades i 2 dagar med forskolin (FSK) eller DMSO-fordon som kontroll (kon). Alla skalfält representerar 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här baserades på en nyligen publicerad16. Viss uppmärksamhet bör ägnas åt följande kritiska steg för att uppnå bästa resultat med den nya metoden. För det första är framgångsrik separation av epidermis och dermis avgörande. Skär den vuxna förhuden vävnader i 3-4 mm breda remsor med hjälp av en skalpell blad för att göra dispas arbete mer noggrant och enkelt att skilja epidermis från dermis. För det andra, när separera dessa två lager, bör kontaminering av dermis undvikas eftersom dermala fibroblaster kan också växa i melanocyte odlingsmedium. För det tredje bör trypsin matsmältningen steg vara mindre än 30 min; Annars kommer det att avsevärt minska livskraften hos de isolerade cellerna.
Denna nya metod förkortar avsevärt den tid som behövs för melanocytisolering. Mänskliga epidermala melanocyter producerar melanin, som skyddar huden från sol bestrålning skador. Eisinger och Marko föreslog den första praktiska metoden för kultur av mänskliga melanocyter från epidermis5. Viktigast av allt, de vävnader som används kommer vanligtvis från nyfödda barn och det är mycket svårt att isolera primära melanocyter från vuxna hudvävnader. Den Rho-associerade proteinkinashämmare Y-27632 förbättrar avsevärt effektiviteten av epidermal stamcellsisolering11-13. Dessutom rapporterade vi också en metod för att isolera mänskliga primära epidermala celler från hudvävnader i närvaro av Y-2763210,11. I detta protokoll, Y-27632 visade sig effektivt öka avkastningen av primära melanocyter. Med den konventionella metoden har en låg cell återvinningsgrad och behöver runt 3 till 4 veckors kultur för melanocyter att växa i tillräckligt många för att passage. Denna nya metod, där Y-27632 läggs till TIVA tillväxtmedium, ökad melanocyt avkastning med cirka fem gånger, och melanocyter erhålls kan föröka sig normalt. Vi testade också den nya metoden med hjälp av ett kommersiellt medium och hittade liknande resultat. När det gäller mekanismen visade en nyligen genomförd studie att effekten av Y-27632 för att öka effektiviteten av melanocytisolering sker huvudsakligen genom keratinocyter16.
Viktigt, vi fick rena melanocyter med normal funktion med den nya metoden. Passage 1 (P1) melanocyter var nästan alla färgade för MITF uttryck som anger att rena melanocyter erhålls efter den första passagen. Primära melanocyter med hög tillväxtpotential är mycket viktiga för biologisk forskning och kliniska tillämpningar. De melanocyter som isolerats med den nya metoden kan induceras till pigment efter behandling med forskolin, en aktivator av adenylatcyklas som ökar cykliska AMP-nivåer, vilket indikerar att dessa melanocyter kan fungera normalt, vilket kommer att vara användbart för att studera pigmenteringsdefekter och melanom14.
Sammanfattningsvis var en mycket effektiv metod framgångsrikt fastställts för att isolera primära melanocyter från vuxna hudvävnader. Denna förbättrade metod skulle kunna bidra till att ge ett tillräckligt antal melanocyter på ett snabbt sätt för biologisk forskning och för kliniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar inget intresse av konflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), key program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) och det viktigaste forsknings- och utvecklingsprogrammet för provinsen Shandong (2019GSF108107) till X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) och Grundforskningsfonderna vid Shandong University (2019GN043) till J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
