Avaliação da oxidação celular usando uma proteína fluorescente verde específica do compartimento subcelular
Summary
Este protocolo descreve a avaliação do status de redox específico do compartimento subcelular dentro da célula. Uma sonda fluorescente sensível ao redox permite uma análise racionmétrica conveniente em células intactas.
Abstract
A medição do equilíbrio de oxidação/redução intracelular fornece uma visão geral do estado fisiológico e/ou fisiofisiológico de um organismo. Os tiais são especialmente importantes para iluminar o status de redox das células através de suas relações reduzidas de dithiol e dissulfeto oxidado. Proteínas fluorescentes que contêm cisteína projetadas abrem uma nova era para biosensores sensíveis ao redox. Uma delas, a proteína fluorescente verde sensível ao redox (roGFP), pode ser facilmente introduzida em células com transdução adenoviral, permitindo que o status de redox dos compartimentos subcelulares seja avaliado sem interromper os processos celulares. Cisteínas reduzidas e cistinos oxidados de roGFP têm máxima de excitação em 488 nm e 405 nm, respectivamente, com emissão de 525 nm. Avaliar as proporções dessas formas reduzidas e oxidadas permite o cálculo conveniente do equilíbrio de redox dentro da célula. Neste artigo de método, foram utilizadas células cancerígenas de mama humanas triplas-negativas (MDA-MB-231) para avaliar o estado de redox dentro da célula viva. As etapas do protocolo incluem transdução de linha celular MDA-MB-231 com adenovírus para expressar roGFP citosomico, tratamento com H2O2, e avaliação da razão cisteína e cistina com citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.
Introduction
O estresse oxidativo foi definido em 1985 por Helmut Sies como “uma perturbação no equilíbrio prooxidante-antioxidante em favor do primeiro”1, e uma infinidade de pesquisas foi conduzida para obter o estado de redox específico da doença, nutrição e envelhecimento dos organismos1,,2,,3. Desde então, a compreensão do estresse oxidativo tornou-se mais ampla. Testar as hipóteses do uso de antioxidantes contra doenças e/ou envelhecimento mostrou que o estresse oxidativo não só causa danos, mas também tem outros papéis nas células. Além disso, os cientistas mostraram que os radicais livres desempenham um papel importante para a transdução de sinais2. Todos esses estudos reforçam a importância de determinar as mudanças na razão de redução-oxidação (redox) das macromoléculas. A atividade enzimápica, antioxidantes e/ou oxidantes e produtos de oxidação podem ser avaliados com vários métodos. Entre estes, os métodos que determinam a oxidação do tiol são indiscutivelmente os mais utilizados porque relatam o equilíbrio entre antioxidantes e prooxidantes nas células, bem como organismos4. Especificamente, as relações entre glutationa (GSH)/glutatione dissulfeto (GSSG) e/ou cisteína (CyS)/cystine (CySS) são usadas como biomarcadores para monitorar o estado redox dos organismos2.
Os métodos utilizados para avaliar o equilíbrio entre prooxidantes e antioxidantes dependem principalmente dos níveis de proteínas reduzidas/oxidadas ou pequenas moléculas dentro das células. Manchas ocidentais e espectrometria de massa são usadas para avaliar amplamente as proporções de macromoléculas reduzidas/oxidadas (proteínas, lipídios etc.), e as razões GSH/GSSG podem ser avaliadas com espectrofotometria5. Uma característica comum desses métodos é a perturbação física do sistema por lise celular e/ou homogeneização tecidual. Essas análises também se tornam desafiadoras quando é necessário medir o estado de oxidação de diferentes compartimentos celulares. Todas essas perturbações causam artefatos no ambiente de ensaio.
Proteínas fluorescentes sensíveis ao redox abriram uma era vantajosa para avaliar o equilíbrio redox sem causar perturbação nas células6. Eles podem atingir diferentes compartimentos intracelulares, permitindo a quantificação de atividades específicas do compartimento (por exemplo, o que diz respeito ao estado redox das mitocôndrias e do citosol) para investigar o crosstalk entre organelas celulares. Proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente verde (GFP) e proteínas HyPeR são revisadas por Meyer e colegas6. Entre essas proteínas, o GFP sensível ao redox (roGFP) é único devido a diferentes leituras fluorescentes de seus resíduos CyS (ex. 488 nm/em. 525 nm) e CySS (ex. 405 nm/525 nm), que permitem análise ratiométrica, ao contrário de outras proteínas sensíveis à redox, como YFP7,8. A saída racionada é valiosa porque contrabalança as diferenças entre os níveis de expressão, sensibilidades de detecção e fotobleaching8. Compartimentos subcelulares de células (citoso, mitocôndrias, núcleo) ou organismos diferentes (bactérias, bem como células mamíferas) podem ser alvo modificando roGFP7,,9,10.
Os ensaios roGFP são conduzidos utilizando técnicas de imagem fluorescente, especialmente para experimentos de visualização em tempo real. Análises citométricas de fluxo de roGFPs também são possíveis para experimentos com pontos de tempo predeterminados. O artigo atual descreve tanto o uso de microscopia fluorescente quanto a citometria de fluxo para realizar uma avaliação ratiométrica do estado de redox em células de mamíferos superexpressando roGFP (direcionado para citosol) via transdução adenoviral.
Protocol
Representative Results
Discussion
O equilíbrio tiol/dissulfeto em um organismo reflete o estado redox das células. Organismos vivos têm glutationa, cisteína, tialis proteicos e tiols de baixo peso molecular, todos afetados pelo nível de oxidação e ecoam o estado redox das células4. RoGFPs projetados permitem a quantificação sem interrupções do equilíbrio thiol/dissulfeto através de seus resíduos CyS7. A propriedade racionmétrica do roGFP fornece medições de redox confiáveis para células …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O adenovírus construto e recombinante para a expressão de roGFP específico para citosol em células foram gerados no laboratório de Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University e ViraQuest Inc., respectivamente. Este estudo foi apoiado pelo Centro de Estudos de Resposta ao Câncer P20GM109005 através do INSTITUTO Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH Centros de Excelência em Pesquisa Biomédica (COBRE NIGMS), Instituto Nacional de Clínicas Médicas Gerais Programa de Pharnacologia e Treinamento toxicológico conceder T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor’s Awards AWD00053484. A instalação do núcleo de citometria de fluxo foi apoiada em parte pelo Centro de Patogênese Microbiana e Respostas Inflamatórias hospedeiras que concedem P20GM103625 através do COBRE NIGMS. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH. A ATA foi apoiada pela bolsa de estudos 2214-A do Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TUBITAK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
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