Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Summary

Um método altamente paralelo para medir o decote específico do DNA no nível da molécula única é descrito. Este protocolo demonstra a técnica utilizando a restrição endonuclease NdeI. O método pode ser facilmente modificado para estudar qualquer processo que resulte em decote de DNA específico do local.

Abstract

O decote de DNA específico do local (SSDC) é um passo fundamental em muitos processos celulares, e é crucial para a edição de genes. Este trabalho descreve um ensaio cinético capaz de medir SSDC em muitas moléculas de DNA únicas simultaneamente. DNAs substratos amarrados por contas, cada um contendo uma única cópia da sequência de destino, são preparados em um canal de fluxo microfluido. Um ímã externo aplica uma força fraca às contas paramagnéticas. A integridade de até 1.000 DNAs individuais pode ser monitorada visualizando as microesferas sob imagens de campo escuro usando um objetivo de ampliação de campo largo e baixa. A injeção de uma restrição endonuclease, NdeI, inicia a reação do decote. A microscopia de vídeo é usada para registrar o momento exato de cada decote de DNA observando o quadro em que a conta associada se move para cima e para fora do plano focal do objetivo. A contagem de contas quadro a quadro quantifica a reação, e um ajuste exponencial determina a taxa de reação. Este método permite a coleta de dados quantitativos e estatisticamente significativos sobre reações SSDC de molécula única em um único experimento.

Introduction

O decote de DNA específico do local (SSDC) é um passo fundamental em muitas transações genômicas. Por exemplo, os sistemas de modificação de restrição bacteriana (RM)¹ e CRISPR² protegem as células contra ataques por phages e plasmídeos, reconhecendo e cortando DNA estranho em sequências específicas. No tipo II RM, as endonucleases de restrição (REs) reconhecem sequências curtas de 4 a 8 pares de bases (bp) através de interações proteicas-nucleicas³. Endonucleases associados ao CRISPR, como o Cas9, ligam-se a locais via hibridização do local alvo com crRNAs vinculados aos endonucleases⁴. A criação de quebras duplas encalhadas específicas do local (DSBs) também são o primeiro passo em muitos eventos de recombinação de DNA⁵. Por exemplo, a diversidade de regiões de ligação de antígenos criadas pela recombinação V(D)J requer o reconhecimento e o decote de locais de destino específicos⁶. Alguns transposons são conhecidos por atingir sequências específicas de DNA, bem como⁷. Não surpreende que muitos núcleos específicos do site envolvidos nesses processos, como o Cas9, sejam um componente-chave das tecnologias de edição de genes⁸. Além disso, novos endonucleases específicos do local (ou seja, núcleos de dedo de zinco⁹ e TALENS¹⁰) também foram projetados para editar genomas.

Muitos métodos têm sido empregados para medir a cinética do decote específico do local dos ácidos nucleicos. Estes incluem análise de gel, fluorescência^11,,12e métodos baseados em sequenciamento¹³. Um grande avanço foi alcançado com o amarramento de microesferas, que permite que DSBs em moléculas únicas de DNA sejam detectados pelo movimento de uma conta após a separação da vertente. Nestes métodos, diferentes tipos de forças são empregadas para garantir a separação da vertente e o movimento do pós-decote da conta. Em um caso, armadilhas ópticas têm sido usadas para medir o decote do DNA pelo EcoRV¹⁴. Nesses experimentos, a busca de alvos é o objetivo da investigação, com condições otimizadas para que a vinculação específica do local seja a etapa limitante da taxa. Uma desvantagem das armadilhas ópticas é que apenas um único DNA pode ser observado de cada vez. Além disso, uma força de puxar grande periódica deve ser aplicada para testar a separação da vertente.

Outra técnica usa uma combinação de fluxo e forças magnéticas fracas para puxar a conta de forma contínua¹⁵. Desta forma, a difusão limitada do decote por NdeI é medida. O método utilizado permite a medição simultânea de várias centenas de DNAs ao mesmo tempo, permitindo que a significância estatística seja alcançada em um único experimento. Experimentos baseados em pinças magnéticas também foram usados. Em um desses estudos, foi estudada uma integração retroviral por meio da inclusão de um DSB na inserção oligonucleotídeo¹⁶. A integração bem sucedida resultou na incorporação do DSB no DNA amarrado e na perda da conta anexada. Em estudo semelhante da restrição do tipo III dependente do ATP EcoPI, dezenas de DNAs foram observados em um único experimento¹⁷. Pinças magnéticas têm a vantagem de que a tensão, bem como o looping de DNA, podem ser controlados e monitorados durante a reação.

Apresentado aqui é um método de molécula única altamente paralelo para medir cinética SSDC, que se aproveita de melhorias recentes no tethering em larga escala de DNAs. Este método é uma melhoria e extensão dos métodos anteriores usados para medir a replicação de DNA¹⁸, comprimento do contorno do DNA¹⁹e decote por REs¹⁵. Nesta técnica, DNAs lineares contendo uma única cópia da sequência de reconhecimento são preparados com biotina em uma extremidade e digoxigenina na outra. A biotina liga streptavidin, que é covalentemente ligado a uma microesfera paramagnética. Os complexos de contas de DNA são injetados em um canal microfluido que foi funcionalizado com fragmentos da FAB anti-digoxigenina. O DNA então se liga aos pontos de fixação da superfície através da ligação da digoxigenina aos fragmentos da FAB adsorvidas. Forças magnéticas fracas aplicadas com um ímã permanente impedem que a conta grude não especificamente na superfície. As amostras podem ser injetadas rapidamente (<30 s) no canal de fluxo para ativar a reação do decote. O fluxo é desligado durante a coleta de dados. À medida que cada DNA é cortado, o tempo exato do decote pode ser determinado registrando o quadro em que a conta se move para cima e para fora do plano focal do objetivo, desaparecendo assim do registro de vídeo. Uma contagem quadro a quadro de contas remanescentes pode ser usada para quantificar o progresso da reação.

Apresentado abaixo está o protocolo completo, bem como exemplos de dados coletados usando o NdeI. Como exemplo de como a técnica pode ser aplicada, as taxas de decote para uma série de concentrações proteicas são medidas em duas concentrações diferentes de magnésio, um coator metálico essencial. Embora esta aplicação do protocolo use NdeI, o método pode ser adaptado para uso com qualquer nuclease específica do local, variando o design do substrato de DNA.

Protocol

1. Fazer a célula de fluxo Lavando as tampas Coloque manchas em frascos de coloração e sonicate com etanol (EtOH), depois com 1 M KOH (por 30 min cada). Para evitar a precipitação KOH em EtOH, enxágue bem com ddH2O entre as lavagens. Repita tanto o EtOH quanto as etapas de lavagem KOH 1x para um número total de quatro lavagens (duas EtOH e duas KOH). Armazene tampas limpas em ddH2O em frascos de coloração. Corte os tubos de carga e saída …

Representative Results

Utilizando esta técnica, as taxas de SSDC de NdeI foram medidas para uma gama de concentrações proteicas (0,25-4,00 U/mL) em duas concentrações diferentes de magnésio (2 mM e 4 mM). Cada uma dessas condições foi replicada pelo menos duas vezes, com algumas centenas a 1.000 DNAs amarrados por experimento. A Figura 2 descreve o design experimental. A Figura 3 mostra exemplos de detalhes de coleta e análise de dados. A Figura 4</strong…

Discussion

O protocolo pode ser usado para medir a cinética de qualquer sistema SSDC, desde que a separação da vertente seja observada durante o experimento. A detecção do decote é afetada pela observação do desprendimento da conta amarrada e, portanto, marca o instante da separação do fio. Todas as etapas anteriores ocorrem antes da detecção do decote; assim, apenas o tempo total de trânsito é registrado.

O deslizamento de cobertura da célula de fluxo é funcionalizado através de adsorç…

Materials

5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905