En high-throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation og fokuseret ultralyd system til blod-hjerne barrieren Åbning i gnavere

Summary

Blod-hjerne barrieren (BBB) kan midlertidigt forstyrres med mikroboble-medieret fokuseret ultralyd (FUS). Her beskriver vi en trinvis protokol for BBB-åbning i høj overførselshastighed ved hjælp af et modulært FUS-system, der er tilgængeligt for ikke-ultralydseksperter.

Abstract

Blod-hjerne barrieren (BBB) har været en stor forhindring for behandling af forskellige hjernesygdomme. Endotelceller, der er forbundet med stramme vejkryds, danner en fysiologisk barriere, der forhindrer store molekyler (>500 Da) i at komme ind i hjernevævet. Mikroboble-medieret fokuseret ultralyd (FUS) kan bruges til at fremkalde en forbigående lokal BBB åbning, så større lægemidler til at komme ind i hjernen parenchyma.

Ud over store kliniske enheder til klinisk oversættelse kræver præklinisk forskning til vurdering af lægemiddelkandidaters behandlingsrespons dedikerede små ultralydsopsætninger til målrettet BBB-åbning. Disse systemer giver helst mulighed for arbejdsprocesser med høj gennemløb med både høj rumlig præcision og integreret kavitationsovervågning, samtidig med at de stadig er omkostningseffektive i både initialinvestering og driftsomkostninger.

Her præsenterer vi et bioluminescens- og røntgenstyret stereotaktisk FUS-system til små dyr, der er baseret på kommercielt tilgængelige komponenter og opfylder ovennævnte krav. Der er lagt særlig vægt på en høj grad af automatisering, der letter de udfordringer, der typisk opstår i prækliniske narkotikavurderingsundersøgelser med store mængder. Eksempler på disse udfordringer er behovet for standardisering for at sikre datagen reproducerbarhed, reducere variabilitet inden for grupper, reducere stikprøvestørrelsen og dermed overholde etiske krav og reducere unødvendig arbejdsbyrde. Det foreslåede BBB-system er blevet valideret inden for rammerne af BBB,der åbner faciliterede lægemiddelleveringsforsøg på patientbaserede xenograftmodeller af glioblastoma multiforme og diffuse midline glioma.

Introduction

Blod-hjerne barrieren (BBB) er en stor hindring for levering af narkotika i hjernen parenchyma. De fleste terapeutiske lægemidler, der er udviklet, krydser ikke BBB på grund af deres fysiskkemiske parametre (f.eks. lipofilicitet, molekylvægt, hydrogenbindingstagere og donorer) eller bevares ikke på grund af deres affinitet for efflux-transportører i hjernen^1,2. Den lille gruppe af lægemidler, der kan krydse BBB, er typisk små lipofile molekyler, som kun er effektive i et begrænset antal hjernesygdomme^1,2. Som følge heraf er farmakologiske behandlingsmuligheder begrænsede for de fleste hjernesygdomme, og der er behov for nye lægemiddelleveringsstrategier^3,4.

Terapeutisk ultralyd er en ny teknik, der kan bruges til forskellige neurologiske applikationer som BBB-forstyrrelse (BBBD), neuromodulation og ablation^4,5,6,7. For at opnå en BBB-åbning med en ekstracorporeal ultralydsudleder gennem kraniet kombineres fokuseret ultralyd (FUS) med mikrobobler. Mikroboble-medieret FUS resulterer i øget biotilgængelighed af lægemidler i hjernen parenchyma^5,8,9. I nærværelse af lydbølger begynder mikrobobler at svinge indlede transcytose og forstyrrelse af de stramme kryds mellem BBB’s endotelceller, hvilket muliggør paracellulær transport af større molekyler¹⁰. Tidligere undersøgelser bekræftede sammenhængen mellem intensiteten af den akustiske emission og den biologiske indvirkning på BBB-åbning^11,12,13,14. FUS i kombination med mikrobobler er allerede blevet anvendt i kliniske forsøg til behandling af glioblastoma ved hjælp af temozolomide eller liposomal doxorubicin som kemoterapeutisk middel eller til behandling af Alzheimers sygdom og amyotrofisk lateral sklerose^5,9,15,16.

Da ultralyd medieret BBB åbning resulterer i helt nye muligheder for farmakoterapi, præklinisk forskning for klinisk oversættelse er nødvendig for at vurdere behandlingen respons af udvalgte lægemiddelkandidater. Dette kræver typisk en arbejdsgang med høj gennemløb med både høj rumlig præcision og helst en integreret kavitationsregistrering til overvågning af målrettet BBB-åbning med høj reproducerbarhed. Hvis det er muligt, skal disse systemer være omkostningseffektive i både initialinvesteringer og driftsomkostninger for at kunne skaleres i henhold til undersøgelsens størrelse. De fleste prækliniske FUS-systemer kombineres med MR-scanning til billedvejledning og behandlingsplanlægning^15,17,18,19. Selv om MR giver detaljerede oplysninger om tumor anatomi og volumen, det er en dyr teknik, som generelt udføres af uddannede / dygtige operatører. Derudover er MR-scanning i høj opløsning muligvis ikke altid tilgængelig for forskere i prækliniske faciliteter og kræver lange scanningstider pr. dyr, hvilket gør det mindre egnet til farmakologiske undersøgelser med høj gennemløb. Bemærkelsesværdigt er, at for præklinisk forskning inden for neuro-onkologi, især infiltrerende tumormodeller, er muligheden for at visualisere og målrette tumoren afgørende for behandlingssucces²⁰. I øjeblikket er dette krav kun opfyldt af MR eller af tumorer transduceret med et fotoprotein, der muliggør visualisering med bioluminescens imaging (BLI) i kombination med administration af photoprotein substratet.

MR-styrede FUS-systemer bruger ofte et vandbad til at sikre ultralydbølgeudbredelse til transkraniale applikationer, hvor dyrets hoved delvist er nedsænket i vandet, de såkaldte ”bottom-up”-systemer^15,17,18. Mens disse designs fungerer generelt godt i mindre dyreforsøg, er de et kompromis mellem dyreforberedelsestider, bærbarhed og realistisk vedligeholdbare hygiejniske standarder under brug. Som et alternativ til MRI omfatter andre styremetoder til stereotaktisk navigation brugen af et anatomisk atlas over gnavere^21,22,23, laserpegepind assisteret visuel observation²⁴, pinhole-assisteret mekanisk scanningsenhed²⁵eller BLI²⁶. De fleste af disse designs er “top-down” systemer, hvor transduceren er placeret oven på dyrets hoved, med dyret i en naturlig position. ”Top-down’-arbejdsgangen består enten af et vandbad^22,25,26 eller en vandfyldt kegle^21,24. Fordelen ved at bruge en transducer inde i en lukket kegle er det mere kompakte fodaftryk, kortere opsætningstid og ligetil dekontamineringsmuligheder, der forenkler hele arbejdsgangen.

Samspillet mellem det akustiske felt og mikroboblerne er trykafhængigt og spænder fra svingninger med lav amplitude (kaldet stabil kavitation) til forbigående boblekollaps (kaldet inertial kavitation)^27,28. Der er en etableret konsensus om, at ultralyd-BBBD kræver et akustisk tryk et godt stykke over den stabile kavitationstærskel for at opnå vellykket BBBD, men under den inertielle kavitationstærskel, som generelt er forbundet med vaskulær / neuronal skade²⁹. Den mest almindelige form for overvågning og kontrol er analysen af det (back-)spredte akustiske signal ved hjælp af passiv kavitationsdetektering (PCD), som foreslået af McDannold et al.¹². PCD bygger på analysen af Fourier spektre af mikroboble emissionssignaler, hvor styrken og udseendet af stabile kavitation kendetegnende (harmoniske, subharmonics, og ultraharmonics) og inertial kavitation markører (bredbånd svar) kan måles i realtid.

En “one size fits all” PCD-analyse for præcis trykkontrol er kompliceret på grund af mikrobobleformuleringens polydispersitet (svingningsforstærkningen afhænger stærkt af boblediameteren), forskellene i bobleskalegenskaber mellem mærker og den akustiske svingning, som afhænger stærkt af frekvens og tryk^30,31,32. Som følge heraf er der foreslået mange forskellige PCD-detektionsprotokoller, som er blevet tilpasset bestemte kombinationer af alle disse parametre og er blevet brugt i forskellige applikationsscenarier (lige fra in vitro-forsøg over små dyreprotokoller til PCD til klinisk brug) til robust kavitationsdetektion og endda til tilbagevirkende feedbackkontrol af trykket^{11,14,30,31,32,33,34,35}. Pcd-protokollen, der anvendes i forbindelse med denne undersøgelse, er afledt direkte af McDannold et al.¹² og overvåger den harmoniske emission for tilstedeværelsen af stabil kavitation og bredbåndsstøj til inertikavitationsdetektion.

Vi har udviklet et billedstyret neuronavigation FUS-system til forbigående åbning af BBB for at øge lægemiddelleveringen til hjerneparenchymaet. Systemet er baseret på kommercielt tilgængelige komponenter og kan let tilpasses flere forskellige billedbehandlingsmetoder, afhængigt af de tilgængelige billeddannelsesteknikker i dyrefaciliteten. Da vi har brug for en arbejdsgang med høj overførselshastighed, har vi valgt at bruge røntgen og BLI til billedvejledning og behandlingsplanlægning. Tumorceller transduceret med et photoprotein (f.eks luciferase) er egnet til BLI imaging²⁰. Efter administration af fotoproteinsubstratet kan tumorceller overvåges in vivo og tumorvækst og placering kan bestemmes^20,36. BLI er en billig billedbehandling modalitet, det gør det muligt at følge tumorvæksten over tid, det har hurtige scanningstider, og det korrelerer godt med tumorvækst målt med MRI^36,37. Vi har valgt at erstatte vandbadet med en vandfyldt kegle fastgjort til transduceren for at muliggøre fleksibilitet til frit at flytte den platform, hvorpå gnaveren er monteret^8,24. Designet er baseret på en aftagelig platform udstyret med integration af (I) stereotaktiske platformer til små dyr (II) fiduciale markører med både røntgen- og optisk billedkompatibilitet (III) hurtig aftagelig anæstesimaske og (IV) integreret temperaturreguleret dyreopvarmningssystem. Efter den første induktion af anæstesi monteres dyret i en præcis position på platformen, hvor det forbliver under hele proceduren. Derfor passerer hele platformen alle stationer i arbejdsgangen for hele interventionen, samtidig med at den opretholder en nøjagtig og reproducerbar positionering og vedvarende anæstesi. Kontrolsoftwaren gør det muligt automatisk at registrere de fiduciale markører og registrerer automatisk alle typer billeder og billedmodaliteter (dvs. mikro-CT, X-ray, BLI og fluorescensbilleddannelse) i referencerammen for den stereotaktiske platform. Ved hjælp af en automatisk kalibreringsprocedure er ultralydtransducerens brændvidde præcist kendt inden for, hvilket muliggør automatisk fusion af interventionel planlægning, akustisk levering og opfølgende billedanalyse. Som vist i figur 1 og figur 2giver denne opsætning en høj grad af fleksibilitet til at designe dedikerede eksperimentelle arbejdsgange og tillader interleaved håndtering af dyret på forskellige stationer, hvilket igen letter eksperimenter med høj gennemløb. Vi har brugt denne teknik til vellykket levering af lægemidler i mus xenografts af høj kvalitet gliom såsom diffus midline glioma.

Protocol

Alle in vivo-eksperimenter blev godkendt af det hollandske etiske udvalg (licenstilladelsesnummer AVD114002017841) og Dyrevelfærdsorganet ved Vrije Universiteit Amsterdam, Holland. Efterforskerne blev uddannet i det grundlæggende i FUS-systemet for at minimere dyrenes ubehag. 1. Fokuseret ultralydssystem BEMÆRK: Den beskrevne opsætning er et indbygget bygget BBB-disruptionsystem baseret på kommercielt tilgængelige komponenter og omfatter en 3D-printet specialfre…

Representative Results

Det beskrevne FUS-system (figur 1 og figur 2) og den tilhørende arbejdsgang er blevet brugt i over 100 dyr og produceret reproducerbare data om både sunde og tumorbærende mus. Baseret på den registrerede kavitation og spektraltætheden ved overtonerne i det højeste øjeblik af mikrobubble bolus injektionen kan spektraleffekten af hver frekvens beregnes ved hjælp af Fourier-analysen som forklaret i trin 4 i protokollen. Baseret på den akustiske protokol (1…

Discussion

I denne undersøgelse udviklede vi et omkostningseffektivt billedstyret baseret FUS-system til forbigående BBB-forstyrrelse for øget lægemiddellevering til hjerneparenchymaet. Systemet blev stort set bygget med kommercielt tilgængelige komponenter og i samarbejde med X-ray og BLI. Modulariteten af det foreslåede design gør det muligt at anvende flere billedbehandlingsmetoder til planlægning og vurdering i arbejdsgange med høj overførselshastighed. Systemet kan kombineres med mere omfattende 3D-billedbehandlingsm…

Materials

1 mL luer-lock syringe	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G needle	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G needle	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore surgical tape	Science applied to life	7000032707	or similar
Arbitrary waveform generator	Siglent	n.a.	SDG1025, 25 MHz, 125 Msa/s
Automated stereotact	in-house built	n.a.	Stereotact with all elements were in-house built
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	Includes software
Buffered NaCl solution	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
Buprenorfine hydrochloride	Indivior UK limitd	n.a.	0.324 mg
Cage enrichment: paper-pulp smart home	Bio services	n.a.
Carbon filter	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
Ceramic spoon	n.a	n.a.
Cotton swabs	n.a.	n.a.
D-luciferin, potassium salt	Gold Biotechnology	LUCK-1
Ethanol	VUmc pharmacy	n.a.	70%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	n.a.	NaCl 0.9 %, 1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	n.a.	Histoacryl 0.5 mL
Hydrophone	Precision Acoustics	n.a.
Insulin syringe	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL and 0.3 mL
Isoflurane	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
Ketamine	Alfasan	n.a.	10 %, 10 mL
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet	Envigo	2918-11416M
Neoflon catheter	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
Oscilloscope	Keysight technologies	n.a.	InfiniiVision DSOX024A
Plastic tubes	Greiner bio-one	210261	50 mL
Power amplifier	Electronics & Innovation Ltd	210L	Model 210L
Preamplifier DC Coupler	Precision Acoustics	n..	Serial number: DCPS94
Scissors	Sigma Aldrich	S3146-1EA	or similar
Sedazine	AST Farma	n.a.	2%
SonoVue microbubbles	Bracco	n.a.	8 µl/ml
Sterile water	Fresenius Kabi	n.a.	1000 mL
Syringe	n.a.	n.a.	various syringes can be used
Temgesic	Indivior UK limitd	n.a.	0.3 mg/ml
Transducer	Precision Acoustics	n.a.	1 MHz
Tweezers	Sigma Aldrich	F4142-1EA	or similar
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic gel	Bausch + Lomb	n.a.	10 g