نمذجة الانبثاث الدماغ من خلال الحقن داخل الجمجمة والتصوير بالرنين المغناطيسي
Summary
تعقيد نمذجة الانبثاث الدماغ داخل الجمجمة بسبب عدم القدرة على رصد حجم الورم والاستجابة للعلاج مع أساليب دقيقة وفي الوقت المناسب. المنهجية المقدمة الأزواج حقن الورم داخل الجمجمة مع تحليل التصوير بالرنين المغناطيسي, الذي عند الجمع, يزرع الحقن دقيقة ومتسقة, تعزيز رصد الحيوانات, وقياسات حجم الورم دقيقة.
Abstract
الانتشار النقيلي للسرطان هو نتيجة مؤسفة لتطور المرض، وأنواع السرطان الفرعية العدوانية، و / أو التشخيص المتأخر. الانبثاث الدماغية مدمرة بشكل خاص ، يصعب علاجها ، وتمنح تشخيصًا ضعيفًا. في حين أن الإصابة الدقيقة من الانبثاث الدماغ في الولايات المتحدة لا يزال من الصعب تقدير, فمن المرجح أن تزيد مع استمرار العلاجات خارج تصبح أكثر فعالية في علاج السرطان. وبالتالي ، من الضروري تحديد وتطوير أساليب علاجية جديدة لعلاج الانبثاث في هذا الموقع. وتحقيقا لهذه الغاية، أصبح الحقن داخل الجمجمة من الخلايا السرطانية وسيلة راسخة في نموذج الانبثاث الدماغ. في السابق، كان عدم القدرة على قياس نمو الورم بشكل مباشر عائقاً تقنياً لهذا النموذج؛ ومع ذلك، فإن زيادة توافر وجودة طرائق التصوير الحيواني الصغيرة، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، تحسن بشكل كبير القدرة على رصد نمو الورم مع مرور الوقت واستنتاج التغيرات داخل الدماغ خلال الفترة التجريبية. هنا ، ثبت الحقن داخل الجمجمة من خلايا الورم الثدي مورين في الفئران المناعية تليها التصوير بالرنين المغناطيسي. أسلوب الحقن المقدم يستخدم التخدير isoflurane والإعداد stereotactic مع التحكم رقميا، وثقب الآلي وحقن إبرة لتعزيز الدقة، والحد من الخطأ التقني. يتم قياس التصوير بالرنين المغناطيسي مع مرور الوقت باستخدام أداة تسلا 9.4 في جامعة ولاية أوهايو جيمس الشامل مركز السرطان الصغيرة تصوير الحيوانات الموارد المشتركة. يتم عرض قياسات حجم الورم في كل نقطة زمنية من خلال استخدام ImageJ. عموما، هذا النهج الحقن داخل الجمجمة يسمح لحقن دقيق، الرصد اليومي، وقياسات حجم الورم دقيقة، والتي جمعت تعزيز كبير من فائدة هذا النظام النموذجي لاختبار الفرضيات رواية على محركات الانبثاث الدماغ.
Introduction
الانبثاث الدماغ هي 10 مرات أكثر شيوعا من البالغين الأولية أورام الجهاز العصبي المركزي1, وقد تم الإبلاغ في تقريبا كل نوع الورم الصلبة مع سرطان الرئة, سرطان الثدي, وسرطان الجلد تظهر أعلى معدل2. بغض النظر عن موقع الورم الأساسي ، فإن تطور الانبثاث الدماغي يؤدي إلى سوء التكهن غالباً ما يرتبط بالتدهور المعرفي ، والصداع المستمر ، والنوبات ، والتغيرات السلوكية و / أو الشخصية1،3،4،5. وفيما يتعلق بسرطان الثدي، فقد كان هناك العديد من التطورات في الوقاية من المرض وعلاجه. ومع ذلك، فإن 30٪ من النساء تشخيص سرطان الثدي على المضي في تطوير الانبثاث، وأولئك الذين يعانون من مرض المرحلة الرابعة، ما يقرب من 7٪ (SEER 2010-2013) لديهم الانبثاث الدماغ6،7. وتشمل خيارات العلاج الحالية للأشعة على الانبثاث الدماغ استئصال جراحي, stereotac stereosurgery و / أو العلاج الإشعاعي الدماغ كله. ومع ذلك ، حتى مع هذا العلاج العدواني ، فإن متوسط البقاء على قيد الحياة لهؤلاء المرضى هو قصيرة 8-11 شهرا7،8،9. وتدعم هذه الإحصاءات القاتمة بقوة الحاجة إلى تحديد وتنفيذ استراتيجيات علاجية جديدة وفعالة. وهكذا، كما هو الحال مع جميع أنواع السرطان التي تنتقل إلى الدماغ، فمن الضروري أن نموذج سرطان الثدي المرتبطة بشكل صحيح الانبثاث الدماغ (BCBM) في المختبر لضمان تقدم كبير في هذا المجال.
حتى الآن، استخدم الباحثون مجموعة متنوعة من المنهجيات لدراسة آليات الانبثاث إلى الدماغ، ولكل منها مزايا وقيود متميزة10،11. طرق الانبثاث التجريبية مثل الوريد الذيل والحقن داخل القلب نشر الخلايا السرطانية في جميع أنحاء الجسم ويمكن أن يؤدي إلى عبء الورم الهائل في المواقع النقيلي الأخرى اعتمادا على الخلايا المحقونة. ثم تربك هذه النتائج إذا كانت تدرس على وجه التحديد الانبثاث إلى الدماغ. طريقة حقن الشريان داخل الكاروتية مفيد لأنه يستهدف على وجه التحديد بذر الدماغ من الخلايا السرطانية ولكن محدودة لأنها يمكن أن تكون صعبة من الناحية الفنية لأداء. وغالبا ما يعتبر استئصال الورم الأولي التقويمي النموذج الأكثر صلة سريريا من الانبثاث كما أنه يلخص سلسلة كاملة النقيلي. ومع ذلك، ينطوي هذا النهج على فترات انتظار طويلة لحدوث الانبثاث التلقائي بمعدلات أقل بشكل كبير من الانبثاث الدماغي مقارنة بالمواقع النقيلي الأخرى مثل العقدة الليمفاوية والرئة والكبد. في كثير من الأحيان، يجب إزالة الحيوانات من الدراسات بسبب عبء الورم في هذه المواقع النقيلي الأخرى قبل تطوير الانبثاث الدماغي. طرق أخرى تشمل خطوط الخلايا المدارية في الدماغ فعالة في الانبثاث إلى الدماغ; ومع ذلك، هذه النماذج محدودة من حيث أنها تأخذ وقتاً لتطوير وغالباً ما تفقد tropism مع الانتشار. ونظرا لهذه القيود، فقد استخدم الباحثون بشكل روتيني طريقة الحقن داخل الجمجمة لنموذج الانبثاث السرطانية إلى الدماغ11،12،13،14 مع منهجيات متفاوتة15،16،17،18،19. ومن المسلم به أن هذا النهج له قيود مماثلة، والأهم من ذلك أنه لا يسمح للتحقيق في الخطوات النقيلي في وقت مبكر بما في ذلك داخل الأوعية الدموية من الورم الأساسي، والبينترانس من خلال حاجز الدم في الدماغ، وإنشاء داخل الدماغ. ومع ذلك، فإنه يسمح للباحثين لاختبار (1) ما هي العوامل المشتقة من الورم التوسط النمو داخل الدماغ (على سبيل المثال، التلاعب الجيني لعامل أونكوجيني في الخلايا السرطانية)، (2) كيف التغييرات في البيئة المجهرية النقيلي تغيير نمو السرطان في هذا الموقع (على سبيل المثال، مقارنة بين الفئران المعدلة وراثيا مع مكونات السترمال المعدلة) و (3) فعالية استراتيجيات علاجية جديدة على نمو الآفات المنشأة.
نظراً للفائدة المحتملة لنموذج الحقن داخل الجمجمة, فمن الضروري للغاية للحد من الخطأ التقني أثناء الحقن ومراقبة نمو الورم بدقة مع مرور الوقت. الطريقة المذكورة هنا ينطوي على التسفير المستمر للتخدير الغاز استنشاق، وزرع مباشرة من الخلايا السرطانية في الدماغ parenchyma باستخدام الحفر المجسم وحقن الموقف. يسمح التخدير الغازي بضبط عمق وطول التخدير بالإضافة إلى ضمان الشفاء السريع والسلس. يعزز نظام الحفر الآلي وحقن الإبرة التي يتم التحكم فيها رقميًا دقة موقع الحقن ويقلل من الأخطاء التقنية التي غالباً ما يتم تكبدها عن طريق الحفر وطرق الحقن اليدوي. استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) يزيد من الدقة في رصد نمو الورم وحجم الورم واستجابة الأنسجة ونخر الورم والاستجابة للعلاج. التصوير بالرنين المغناطيسي هو طريقة التصوير من اختيار الأنسجة الرخوة20،21. لا تستخدم تقنية التصوير هذه الإشعاع المؤين، وتفضل على التصوير المقطعي المحوسب (CT)، خاصة بالنسبة لجلسات التصوير المتعددة أثناء الدراسة. التصوير بالرنين المغناطيسي لديه مجموعة أكبر بكثير من تباين الأنسجة الرخوة المتاحة ثم التصوير المقطعي أو الموجات فوق الصوتية (USG) ويعرض التشريح في مزيد من التفاصيل. وهو أكثر حساسية وتحديدا للتشوهات داخل الدماغ نفسه. يمكن إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في أي طائرة التصوير دون الحاجة إلى تحريك هذا الموضوع جسديا كما هو الحال في 2D USG أو التصوير البصري 2D. ومن المهم أن نذكر أن الجمجمة لا تُقيّن إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي كما هو الحال في طرائق التصوير الأخرى. التصوير بالرنين المغناطيسي يسمح بتقييم الهياكل التي قد تكون غامضة من قبل القطع الأثرية من العظام في CT أو USG. ميزة إضافية هي أن هناك العديد من العوامل التباين المتاحة للتصوير بالرنين المغناطيسي، مما يعزز الحد الكشف عن الآفة، مع سمية منخفضة نسبيا أو الآثار الجانبية. الأهم من ذلك، يسمح التصوير بالرنين المغناطيسي للرصد في الوقت الحقيقي على عكس التقييم النسيجي في وقت النخر، والذي يقتصر على فك شفرة حجم الورم. طرائق التصوير الأخرى، مثل التصوير بالإنارة الحيوية، هي فعالة بالفعل للكشف المبكر عن الورم ورصده بمرور الوقت؛ ومع ذلك، تتطلب هذه الطريقة التلاعب الجيني (على سبيل المثال، لوسيفراز/GFP) من خطوط الخلايا ولا تسمح بقياسات الحجم. التصوير بالرنين المغناطيسي هو مزيد من المفيد لأنه يعكس رصد المريض والتحليل الحجمي المصب من الصور MR ومن المعروف أن تكون مرتبطة بقوة لحجم الورم الهستوولوجي في necropsy22. كما يزيد الرصد التسلسلي مع فحص التصوير بالرنين المغناطيسي من المراقبة السريرية للإعاقات العصبية، إذا نشأت.
عموما، الطريقة المعروضة لحقن الورم داخل الجمجمة المجسمة تليها التصوير بالرنين المغناطيسي المسلسل تمكننا من إنتاج نتائج موثوقة وقابلة للتنبؤ وقابلة للقياس لدراسة آليات الانبثاث الدماغ في السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الحقن داخل الجمجمة تليها رصد تسلسلي مع التصوير بالرنين المغناطيسي يوفر قدرة فريدة من نوعها لتصور نمو الورم مع دقة حجم الورم مع مرور الوقت. تطبيق تحليل التصوير الرقمي يسمح لتفسير آفات الدماغ لحجم الورم، والنخر، والاستجابة للعلاج.
كما هو الحال مع أي إجراء، هناك خطوات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل البيانات التمثيلية من خلال المعهد الوطني للسرطان (K22CA218472 إلى G.M.S.). يتم تنفيذ الحقن داخل الجمجمة في جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل التحقق من صحة الموارد المشتركة (مدير – الدكتور رينا شاكيا) ويتم الانتهاء من التصوير بالرنين المغناطيسي في جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل صغير تصوير الحيوانات الموارد المشتركة (مدير – الدكتور كيمرلي باول). يتم تمويل كلا الموارد المشتركة من خلال OSUCCC ، ومنحة دعم مركز السرطان OSUCCC من المعهد الوطني للسرطان (P30 CA016058) ، والشراكات مع كليات جامعة ولاية أوهايو والإدارات ، وأنظمة استرداد الرسوم المعمول بها.
Materials
| Surgical Materials | |||
| Betadine | Purdue Products | 19-027132 | Povidone-iodine, 7.5% |
| Bone Wax | Surgical Specialities | 903 | Sterile and malleable beeswax and isopropyl palmitate |
| Buponorphine SR-Lab | ZooPharm | N/A | Long acting injectable analgesic 5 mL (0.5 mg/mL) polymetric formulation |
| Cotton tip applicators | Puritan | 25-806 10WC | Sterile long stemmed cotton tip applicators |
| Eye Ointment | Puralube | 17033-211-38 | Lubricating petrolatum and mineral oil based ophthalmic ointment |
| Handwarmers | Hothands | HH2 | Air-activated heat packs |
| Ibuprofen | Up & Up | 094-01-0245 | 100mg per 5mL in liquid suspension |
| Isoflurane | Henry Schein INC | 1182097 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| Scalpels | Integra Miltex | 4-410 | #10 disposable scalpel blade |
| Skin Glue | Vetbond | 1469SB | Skin safe wounds adhesive |
| Sterile Dressing | TIDI Products | 25-517 | Individually packed sterile drapes |
| Suture | Covidien | SP5686G | 45cm swedged 5-0 monofilament polypropylene suture |
| Stereotaxic Unit | |||
| High Speed Drill (Foredom) | Kopf | Model 1474 | Max of 38,000 RPM |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 923-B | Mouth bar with teeth hole and nosecone |
| Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 922 | Ear bars suitable for mouse applications |
| Stereotaxic Instrument | Kopf | Model 940 | Base plate, frame and linear scale assembly with digital readout monitor |
| Injector | |||
| Injector Needle and syringe | Hamilton | 80366 | 26 gauge needle, 51 mm needle length and 10 μL volume syringe |
| Legato 130A automated Syringe Pump | KD Scientific | P/N: 788130 | Programmable touch screen base with automated injector |
| Anesthesia Machine | |||
| SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer | Kent Scientific | SS-01 | Digital anesthesia machine |
| SomnoSuite Starter Kit for mice | Kent Scientific | SOMNO-MSEKIT | Includes induction chamber, 2x anesthesia syringes, 18" tubing, plastic nosecone, 2x waste aneshesia gas canisters |
References
- Lin, X., DeAngelis, L. M. Treatment of Brain Metastases. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3475-3484 (2015).
- Ostrom, Q. T., Wright, C. H., Barnholtz-Sloan, J. S. Brain metastases: epidemiology. Handbook of Clinical Neurology. 149, 27-42 (2018).
- Eichler, A. F., et al. The biology of brain metastases-translation to new therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 8 (6), 344-356 (2011).
- Steeg, P. S., Camphausen, K. A., Smith, Q. R. Brain metastases as preventive and therapeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 352-363 (2011).
- Valiente, M., et al. The Evolving Landscape of Brain Metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Wang, H., et al. The prognosis analysis of different metastasis pattern in patients with different breast cancer subtypes: a SEER based study. Oncotarget. 8 (16), 26368-26379 (2017).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Gong, Y., Liu, Y. R., Ji, P., Hu, X., Shao, Z. M. Impact of molecular subtypes on metastatic breast cancer patients: a SEER population-based study. Scientific Reports. 7, 45411 (2017).
- Kim, Y. J., Kim, J. S., Kim, I. A. Molecular subtype predicts incidence and prognosis of brain metastasis from breast cancer in SEER database. Journal of Cancer Researchearch and Clinical Oncology. 144 (9), 1803-1816 (2018).
- Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
- Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
- Meisen, W. H., et al. Changes in BAI1 and nestin expression are prognostic indicators for survival and metastases in breast cancer and provide opportunities for dual targeted therapies. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (1), 307-314 (2015).
- Russell, L., et al. PTEN expression by an oncolytic herpesvirus directs T-cell mediated tumor clearance. Nature Communications. 9 (1), 5006 (2018).
- Thies, K. A., et al. Stromal platelet-derived growth factor receptor-beta signaling promotes breast cancer metastasis in the brain. Cancer Research. , (2020).
- Kramp, T. R., Camphausen, K. Combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model. Journal of Visualized Experiments. (61), e3397 (2012).
- Pierce, A. M., Keating, A. K. Creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors. Journal of Visualized Experiments. (91), e52017 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Donoghue, J. F., Bogler, O., Johns, T. G. A simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Fink, J. R., Muzi, M., Peck, M., Krohn, K. A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (10), 1554-1561 (2015).
- Borges, A. R., Lopez-Larrubia, P., Marques, J. B., Cerdan, S. G. MR imaging features of high-grade gliomas in murine models: how they compare with human disease, reflect tumor biology, and play a role in preclinical trials. American Journal of Neuroradiology. 33 (1), 24-36 (2012).
- Prabhu, S. S., Broaddus, W. C., Oveissi, C., Berr, S. S., Gillies, G. T. Determination of intracranial tumor volumes in a rodent brain using magnetic resonance imaging, Evans blue, and histology: a comparative study. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 47 (2), 259-265 (2000).
- Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical & Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
- Journal of Visualized Experiments. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2020).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures. Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).
- Shah, N., et al. Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases. Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).
