Method Article

腱由来幹細胞の発熱分化を誘導する三次元単軸機械刺激バイオリアクターシステムの適用

DOI:

10.3791/61278

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August 1st, 2020

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1Centre of Orthopaedic Translational Research, Medical School, University of Western Australia

In This Article

Summary

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三次元単軸的な機械的刺激バイオリアクターシステムは、腱由来幹細胞の形質特異的分化およびネオ腱形成のための理想的なバイオリアクターである。

Abstract

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腱障害は、整形外科領域における炎症および変性に関連する一般的な慢性腱疾患である。高い罹患率、限られた自己修復能力、そして最も重要なことは、決定的な治療法がない、腱症は依然として患者の生活の質に悪影響を及ぼさない。腱由来幹細胞(TDSC)は、腱細胞の原発前細胞として、腱障害の発症と腱障害後の機能および構造的回復の両方において重要な役割を果たす。従って、インビトロでTDcSCの腱細胞への分化を模倣できる方法が有用であろう。ここで、本プロトコルは、TDSCを刺激して腱様組織に分化する三次元(3D)単軸ストレッチシステムに基づく方法を説明する。本プロトコルの7つの段階があります:マウスTDSCの単離、マウスTDSCの培養および拡大、細胞シート形成のための刺激培養培地の調製、刺激媒体中の培養による細胞シート形成、3D腱幹細胞構築物の調製、単軸伸張機械的刺激複合体の組立、および機械的刺激体型腱様組織の評価。有効性は、ヒストロジーによって実証された。全体の手順は3週間未満かかります。細胞外マトリックス沈着を促進するために、4.4mg/mLアスコルビン酸を刺激培養培地に使用した。線形モーターが付いている分離された部屋は正確な機械負荷を提供し、携帯用および容易に調節されるバイオリアクターのために適用される。本プロトコルにおける負荷レジームは、6%の株、0.25 Hz、8 h、続いて6日間16時間休息であった。このプロトコルは腱の細胞分化を模倣することができ、腱障害の病理学的プロセスの調査に有用である。さらに、腱様組織は、設計された自家移植片として腱損傷における腱治癒を促進するために使用される可能性がある。要約すると、現在のプロトコルはシンプルで経済的で、再現性があり、有効です。

Introduction

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腱障害は、一般的なスポーツ傷害の一つです。それは主に痛みによって現れます, 局所腫れ, 患部の筋肉の緊張の低下, 機能不全.腱障害の発生率は高い。アキレス腱症の存在は、中長距離ランナー(最大29%)に最も一般的であり、膝蓋腱症の存在はバレーボール(45%)、バスケットボール(32%)、陸上競技(23%)、ハンドボール(15%)、サッカー(13%)1、2、3、4、5の選手でも高い。1,2,3,4,5しかし、腱の自己治癒能力が限られているため、効果的な治療が不足しているため、腱症は依然として患者の生活に負の66,77に影響を及ぼす。さらに、腱障害の病因は不明のままである。その病因について多くの調査が行われてきましたが、主に「炎症理論」、「変性理論」、「使い過ぎ理論」など8.現在、多くの研究者は、腱障害は、腱の経験99、1010の過度の....

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Protocol

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記載された方法は、西オーストラリア大学動物倫理委員会のガイドラインと規制に従って承認され、実施されました。

1. マウスTDSCの分離

  1. 6-8週齢のC57BL/6マウスを子宮頸部脱臼で安楽死させる。
  2. 収穫膝蓋腱24とアキレス腱25.
  3. I型コラゲザーゼ(3mg/mL)の6mLを持つ腱を3時間消化します。
    注:マウスの腱のサイズが小さいので、1つのマウスから収穫されたすべての腱はこのステップで使用する必要があります。
  4. 胎児ウシ血清(FBS)の10%とストレプトマイシンとペニシリン混合物の1%を含む完全な最小必須培地(Α-MEM)で細胞と培養を7日間収集します。
  5. フローサイトメトリーによる蛍光活性化細胞選別(CD44、CD90、Sca-1を含む細胞表面マーカーの発現、CD34およびCD45の発現の欠如)を用いてTDSCを同定する。
  6. 通過および凍結細胞(通路4細胞は、さらなるステップのために使用されます)。

2. マウスTDcの培養と拡大

注:無菌バイオセーフティフードですべてのステップを実行してください。

  1. 温めた細胞(マウ....

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Results

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機械的刺激の前に、TDSCは完全な媒体で100%合流まで成長し、組織化されていない超構造形態を示した(図2A)。機械的ローディングの6日間の単軸ストレッチの後、細胞外マトリックス(ECM)および細胞の配向が良好に配向された(図2B)。細胞は、機械的な負荷の後にECMによく入り込み、よく包まれました。細胞形態は伸長するように提示され、伸張しないものに比べて通常の腱細胞に類似していた(図2C)。ローディングを伴うセル構成体の細胞密度は、ローディングなしのものよりも高かった。QPCRの結果は、本方法が、Scleraxis、Mohawk、テノモジュリン、およびCOL1A1(図3)を含むテノジェニックマーカーの発現を、静的培養によって処理されたものと比較して増加することを示した。

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Discussion

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腱は、メカノイ感受性線維性結合組織である。以前の研究によると、過剰な機械的負荷は腱幹細胞の骨形成分化につながる可能性があり、一方、不十分な負荷は腱分化中にコラーゲン線維構造の乱れにつながる。

一般的な見解は、理想的なバイオリアクターの鍵は、生体内の細胞が受けるインビトロ細胞微小環境をシミュレートする能力であるということです。したがって、インビボ正常応力環境をインビトロで模倣することは、TDCの単一系統分化を腱細胞に刺激する鍵となる。本プロトコルでは、TDSC構成体の幅は2cmであり、フックの移動範囲は0.12cmであり、これは、歪みは0.12/2(%)であった。結論として、TDcは、本プロトコルにおいて6日間(6%、0.25Hz、8時間、続いて16時間の休息)のバイオリアクターにおいて機械的に刺激された。評価後、このプロトコルで使用される機械的負荷パラメータは、TDCが腱様組織を生成するように誘導することが証明されています。なお、バイオリアクターパラメータは、対応するストレッチングシステムの種類と特異的に一致すべきである。例えば、単層.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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著者が「西オーストラリア大学国際料奨学金と西オーストラリア大学大学院賞」を受けている間に研究が行われました。この研究は中国国立自然科学財団(81802214)によって支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アスコルビン酸Sigma-aldrichPHR1008-2G
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco/ by Life Technologies1908361
Histology processorLeicaTP 1020
Minimal Essential Medium (Alpha-MEM)Gibcoä by Life Technologies2003802
Mouse Tendon Derived Stem Cell6〜8週齢のC57BL/6マウスのアキレス腱から単離。その後、I型コラゲナーゼ(3 mg / ml;MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)を3時間放置し、70 mmセルのストレーナーを通過して単一細胞懸濁液を得ました。
パラホルムアルデヒドSigma-aldrich441244
ストレプトマイシンとペニシリンの混合物Gibcoä by Life Technologies15140122
Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor SystemCentre of Orthopaedic Translational Research, University of Western Australiaリクエストに応じて、対応する著者から入手できます。または、私たちのデザインに従ってそれを作る* *Wang T、Lin Z、Day REなど。プログラム可能な機械的刺激は、バイオリアクターシステムにおける腱の恒常性に影響を与えます。バイオテクノルバイオエンジニアリング。2013;110(5):1495–1507。doi:10.1002/bit.24809
TrypsinGibcoä by Life Technologies1858331

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knobloch, K., Yoon, U., Vogt, P. M. Acute and overuse injuries correlated to hours of training in master running athletes. Foot & Ankle International. 29 (7), 671-676 (2008).
  2. Kujala, U. M., Sarna, S., Kaprio, J.

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