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Neuroscience

हिप्पोकैम्पस में वेंट्रल टेगमेंटल एरिया ग्लूटामेट टर्मिनल्स के वीवो शारीरिक और कार्यात्मक ट्रेसिंग में संयुक्त

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस के लिए वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) ग्लूटामेट अनुमानों का पता लगाने के लिए एक सरल विधि को दर्शाता है। वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोटिमुलेशन को सीए1 रिकॉर्डिंग के साथ जोड़ा गया था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल वीवो में CA1 ख्यात पिरामिड फायरिंग दर को कैसे मिलाते हैं।

Abstract

मस्तिष्क में न्यूरॉन उप-आबादी के ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन ने शोधकर्ताओं को वीवो और पूर्व वीवो में तंत्रिका सर्किट को विच्छेदन करने की अनुमति दी है । यह एक तंत्रिका सर्किट के भीतर न्यूरॉन प्रकार की भूमिका का निर्धारण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है, और सीखने के सापेक्ष जानकारी एन्कोडिंग में उनका महत्व है। इसी तरह, इस विधि का उपयोग जागने और एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में दो या अधिक जुड़े मस्तिष्क क्षेत्रों के शारीरिक महत्व का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि कैसे वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स एनेस्थेटाइज्ड चूहों के CA1 (हिप्पोकैम्पस) में ख्यात पिरामिड न्यूरॉन्स की गोलीबारी दर को संशोधित करता है। यह प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस की परतों में वीटीए प्रेसिनैप्टिक ग्लूटामेट टर्मिनलों की ट्रेसिंग के लिए वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) को रोजगार देता है। एएवी वेक्टर द्वारा बंदरगाह वाले प्रकाश-नियंत्रित ऑप्सिन (चैनलरोडोप्सिन; एचएचआर 2) और फ्लोरेसेंस प्रोटीन (ई वाईएफपी) की अभिव्यक्ति ने वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के एंटेरोग्रेड ट्रेसिंग की अनुमति दी, और वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन सेल निकायों (वीटीए में) की फोटोटिमुलेशन की अनुमति दी। वीवो में वीटीए फोटोसिमुलेशन के लिए मल्टी-यूनिट और सिंगल-यूनिट प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए उच्च बाधा तीव्र सिलिकॉन इलेक्ट्रोड सीए1 में तैनात किए गए थे । इस अध्ययन के परिणाम हिप्पोकैम्पस (CA1, CA3, और डीजी) में प्रेसिनैप्टिक वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के परत-निर्भर वितरण को प्रदर्शित करते हैं। साथ ही वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोस्मिमुलेशन ने वीवो में ख्यात CA1 पिरामिड इकाइयों की फायरिंग और फट दर को बढ़ाया।

Introduction

पिछले एक दशक में, न्यूरॉन-प्रकार मॉड्यूलेशन की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की एक सरणी विकसित की गई थी, और जटिल तंत्रिका नेटवर्क1की मैपिंग। विशेष रूप से, न्यूरोट्रोपिक वायरस को संक्रमित करने और न्यूरोनल कोशिकाओं में दोहराने की अंतर्निहित क्षमता वाले न्यूरोट्रॉपिक वायरस को न्यूरॉन उप-प्रकारों में विशिष्ट प्रोटीन को व्यक्त करने या फिर से शुरू करने के लिए तैनात किया गया है। फ्लोरेसेंस प्रोटीन या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सिनैप्टिक गतिविधि संकेतकों को शरण देते समय, संक्रमित एएवी वैक्टर लेबल और मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका नेटवर्क को चित्रित करते हैं2,3। एएवी निर्माण में प्रमोटर का चुनाव कुछ स्तर की विशिष्टता(प्रमोटर-निर्भर अभिव्यक्ति) के साथ न्यूरॉन प्रकारों में वेक्टर की अभिव्यक्ति को निर्देशित करता है। हालांकि, क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन के माध्यम से, एएवी संरचनाओं को न्यूरॉन लेबलिंग 4,5,6,7के लिए अधिक विशिष्टता के साथ तैनात कियाजाताहै। ध्यान दें, एएवी वैक्टर में पैक किए गए फोटोएक्टिवेटेड माइक्रोबियल ऑप्सिन और फ्लोरेसेंस प्रोटीन को विभिन्न न्यूरॉन उपप्रकार8में व्यक्त किया जा सकता है, और इमेजिंग, न्यूरॉन-प्रकार सर्किट ट्रेसिंग और फोटोमॉडुलेशन9,10के लिए आदर्श हैं।

AAVs एक मस्तिष्क क्षेत्र (या नाभिक) में स्टीरियोटैकली इंजेक्शन का निर्माण सोमा, डेंड्राइट, और एक्सॉन टर्मिनलों में रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करता है। एएवी की तंत्रिका अभिव्यक्ति एक रिपोर्टर जीन (ईवाईएफपी) को शरण देने से न्यूरॉन सेल निकायों की लेबलिंग और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों11 , 12,13,14से अनुमानों का शारीरिक पता लगाने में सुविधा होती है । एएवी-ईवाईएफपी प्रकाश नियंत्रित ऑप्सिन (जैसे, एचएचआर 2) को ले जाने वाले निर्माणों को वीवो16में मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए तंत्रिका अनुमानों के इमेजिंग6,15 और उत्तेजना आधारित शारीरिक ट्रेसिंग के लिए एक उपकरण के रूप में तैनात किया जा सकता है। एएवी सेरोटाइप के आधार पर, न्यूरॉन लेबलिंग की दिशा एंटेरोग्रेड या प्रतिगामी11,12हो सकती है। पिछले अध्ययनों से यह सिद्ध हुआ है कि AAV5 न्यूरॉन्स12में एंटीरोग्रेडी यात्रा करता है । इस प्रकार, एचसीआर 2 व्यक्त करने वाले कोशिका निकायों की फोटोस्मिमुलेशन मस्तिष्क (लक्ष्य)17में कहीं और प्रेसिनैप्टिक प्रभाव पैदा करता है।

यहां, CaMKIIα प्रमोटर के साथ एएवी (सेरोटाइप 5) का उपयोग वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स और अक्षीय अनुमानों में eYFP (रिपोर्टर) और एचएचआर 2 (ऑप्सिन) व्यक्त करने के लिए किया गया था। इस अध्ययन के परिणाम सीए1, सीए 3 और डीजी हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों में वीटीए-ग्लूटामेट प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों के परत-निर्भर वितरण को प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोटिमुलेशन ने बेसलाइन मूल्यों की तुलना में वीवो में CA1 मल्टी-यूनिट और सिंगल-यूनिट फायरिंग दरों में वृद्धि की। यह प्रोटोकॉल किफायती उपकरणों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है जो तंत्रिका सर्किट ट्रेसिंग प्रयोगों से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता को बढ़ा सकता है।

Protocol

लुइसियाना स्टेट यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ वेटरनरी मेडिसिन की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा सभी प्रायोगिक और पशु हैंडलिंग प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई । 1. प्रायोगिक प?…

Representative Results

एंटेरोग्रेड ट्रेसिंग AAV अभिव्यक्ति C57BL/6 चूहों के वीटीए में रिपोर्टर प्रोटीन (eYFP) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा सत्यापित किया गया था 21 दिन बाद इंजेक्शन(चित्रा 2)। हिप्पो…

Discussion

पिछले एक दशक में, एएवी निर्माण का डिजाइन काफी उन्नत हो गया है। इस प्रकार, बेहतर ट्रांसफेक्शन विशिष्टता14के लिए एएवी सेरोटाइप की एक सरणी में अधिक न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटरों को शामिल किया गया है।…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम OOM को दिए गए सीबीएस ब्रिजिंग ग्रांट द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। OOM, PAA, और के रूप में अध्ययन डिजाइन और प्रयोगों का प्रदर्शन किया । के रूप में और PAA परिणामों का विश्लेषण किया । OOM और PAA पांडुलिपि तैयार की। हम हमारे उपयोग के लिए एएवी उपलब्ध कराने के लिए डॉ कार्ल डिसेरोथ (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
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References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

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Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
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