JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Hipokampustaki Ventral Tegmental Alan Glutamat Terminallerinin Kombine In Vivo Anatomik ve Fonksiyonel İzlenmesi

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

Mevcut protokol, hipokampusa ventral tegmental alan (VTA) glutamat projeksiyonlarının izlenmesi için basit bir yöntem göstermektedir. VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, VTA glutamat terminallerinin CA1 putatif piramidal ateşleme hızını in vivo olarak nasıl modüle ettiğini göstermek için CA1 kaydı ile birleştirildi.

Abstract

Beyindeki nöron alt popülasyonlarının optogenetik modülasyonu, araştırmacıların in vivo ve ex vivo’daki sinir devrelerini parçalamalarına izin sağlamıştır. Bu, nöron tiplerinin bir sinir devresi içindeki rolünü ve öğrenmeye göre bilgi kodlamasındaki önemini belirlemek için bir öncül sağlar. Aynı şekilde, yöntem uyanık ve uyuşturulmış hayvanlarda iki veya daha fazla bağlı beyin bölgesinin fizyolojik önemini test etmek için kullanılabilir. Mevcut çalışma, VTA glutamat nöronlarının anestezi edilmiş farelerin CA1’deki (hipokampus) putatif piramital nöronların atış hızını nasıl modüle ettiklerini göstermektedir. Bu protokol, hipokampus katmanlarında VTA presynaptik glutamat terminallerinin izlenmesi için VTA glutamat nöronlarının adeno ilişkili virüs (AAV) bağımlı etiketlemesini kullanmaktadır. AAV vektörü tarafından barındırılan ışık kontrollü opsin (channelrhodopsin; hChR2) ve floresan proteininin (eYFP) ekspresyasyonu, VTA glutamat terminallerinin anterograd izlenmesine ve VTA glutamat nöron hücre cisimlerinin (VTA’da) fototimülasyonuna izin verdi. Yüksek empedanslı akut silikon elektrotlar, VTA fotostimülasyonuna in vivo olarak çok birimli ve tek birimli yanıtları tespit etmek için CA1’e yerleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları hipokampustaki (CA1, CA3 ve DG) presynaptik VTA glutamat terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, putatif CA1 piramidal ünitelerinin in vivo ateşlenme ve patlama hızını artırdı.

Introduction

Son on yılda, nöron tipi modülasyonun özgüllüğünü ve karmaşık sinir ağlarının haritalandırılmasını artırmak için bir dizi genetik araç geliştirilmiştir1. Özellikle, nöron alt tiplerinde belirli proteinleri ifade etmek veya alevlendirmek için nöronal hücrelerde enfekte olma ve çoğaltma yeteneğine sahip nörotropik virüsler konuşlandırılmıştır. Floresan proteinleri veya genetik olarak kodlanmış sinaptik aktivite göstergelerini barındırırken, transfected AAV vektörleri beyin bölgelerindeki sinir ağlarını etiketler ve tanımlama2,3. AAV yapısında bir promotörün seçimi, vektörün nöron tiplerinde bir miktar özgüllük(promotöre bağımlı ifade) ile ifadesini yönlendirir. Bununla birlikte, Cre-lox rekombinasyonu sayesinde, AAV yapılarınöron etiketlemesi 4,5,6,7için daha fazla özgüllükle dağıtılır. Not olarak, AAV vektörlerinde paketlenmiş fotoaktive mikrobiyal opsinler ve floresan proteinler çeşitli nöron alt tiplerinde ifade edilebilir8ve görüntüleme, nöron tipi devre izleme ve fotomodülasyon için idealdir9,10.

AAVs, soma, dendrit ve akson terminallerinde muhabir proteininin ekspresyonunun ifadesini yönlendiren bir beyin bölgesine (veya çekirdeğe) stereotaktik olarak enjekte edilen yapılar oluşturur. Bir muhabir geni (eYFP) barındıran AAV’nin sinirsel ifadesi, nöron hücre cisimlerinin etiketlenerek diğer beyin bölgelerine ve diğer beyin bölgelerine yapılan projeksiyonların anatomik olarak izlenmesini kolaylaştırır11,12,13,14. Işık kontrollü opsin taşıyan AAV-eYFP yapıları (örneğin, hChR2),6,15 görüntüleme ve16 vivo beyin bölgelerini hedeflemek için sinirsel projeksiyonların stimülasyontabanlı fizyolojik izleme için bir araç olarak dağıtılabilir. AAV serotipine bağlı olarak, nöron etiketlemenin yönü anterograd veya retrograd11,12olabilir. Önceki çalışmalar, AAV5’in nöronlarda anterograd olarak seyahat ettiğini ortaya12. Böylece, hChR2’yi ifade eden hücre cisimlerinin fotostimülasyonu beynin başka yerlerinde presynaptik etkiler üretir (hedef)17.

Burada VTA glutamat nöronlarında ve aksonal projeksiyonlarda eYFP (muhabir) ve hChR2 (opsin) ifade etmek için CaMKIIα promotörüne sahip AAV (serotip 5) kullanıldı. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, CA1, CA3 ve DG hipokampal bölgelerdeki VTA glutamat presynaptik terminallerinin katmana bağımlı dağılımını göstermektedir. Ayrıca, VTA glutamat nöronlarının fototimülasyonu, temel değerlerle karşılaştırıldığında CA1 çok birimli ve tek birimli ateşleme oranlarını vivo olarak artırdı. Bu protokol, sinir devresi izleme deneylerinden elde edilen verilerin kalitesini artırabilecek uygun fiyatlı araçlar ve ticari olarak kullanılabilen yazılımları kullanır.

Protocol

Tüm deneysel ve hayvan işleme prosedürleri Louisiana Eyalet Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. 1. Deneysel hayvan 5-6 haftalık fareler kullanın. 12 saat değişen ışık ve karanlık döngü standart koşulları altında kafes başına 3-5 hayvan barındırın. Yiyecek ve su reklam libitum sağlanmalıdır. 2. Kraniyotomi ve hayvan hazırlığı <p class…

Representative Results

Anterograd izleme AAV ekspresyolojisi, enjeksiyondan 21 gün sonra C57BL/6 fare vtasında muhabir proteininin (eYFP) immünofluoresans görüntülemesi ile doğrulanmıştır (Şekil 2). Hipokampustaki presynaptik VTA glutamat projeksiyonlarının başarılı anterograd etiketlemesi de DG, CA3 ve CA1 katmanlarında eYFP tespiti ile doğrulandı(Şekil 6a–d; Film 2 ve 3). …

Discussion

Son on yılda, AAV yapılarının tasarımı önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu nedenle, daha fazla nörona özgü promotörler, gelişmiş transfeksiyon özgüllüğü için bir dizi AAV serotipine dahil edilmiştir14. Floresan proteinler, taşıyıcılar, reseptörler ve iyon kanalları için genleri birleştirerek, AAV kütüphaneleri artık görüntüleme, nöromodülasyon ve sinaptik aktivite tespiti için mevcuttur. Ticari olarak mevcut AAV yapılarında, genetik olarak kodlanmış bir flor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, OOM’ye verilen CBS Bridging Grant tarafından finanse edilir. OOM, PAA ve AS çalışmayı tasarladı ve deneyleri gerçekleştirdi. AS ve PAA sonuçları analiz etti. Makaleyi OOM ve PAA hazırladı. Dr. Karl Disseroth’a (Stanford Üniversitesi) AAV’ı kullanımımıza sunduklarından dolayı teşekkür ederiz.

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Tags

Keywords: In Vivo TracingVentral Tegmental AreaGlutamate TerminalsHippocampusOptogeneticsStereotaxic SurgeryExtracellular RecordingAdeno-associated VirusNeurocircuitsNeural Pathways
check_url/61282?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image