JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Kombinerad in Vivo anatomisk och funktionell spårning av ventralt tegmentalområde glutamatterminaler i Hippocampus

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

Det aktuella protokollet visar en enkel metod för spårning av ventrala tegmental område (VTA) glutamat projektioner till hippocampus. Fotostimulering av VTA glutamat nervceller kombinerades med CA1 inspelning för att visa hur VTA glutamat terminaler modulerar CA1 förmodade pyramidal avfyrning hastighet in vivo.

Abstract

Optogenetisk modulering av neuronunderpopulationer i hjärnan har gjort det möjligt för forskare att dissekera neurala kretsar in vivo och ex vivo. Detta ger en förutsättning för att bestämma neurontypers roll inom en neural krets och deras betydelse i informationskodning i förhållande till lärande. På samma sätt kan metoden användas för att testa den fysiologiska betydelsen av två eller flera anslutna hjärnregioner hos vakna och sövda djur. Den aktuella studien visar hur VTA glutamat neuroner modulerar avfyrningshastigheten av förmodade pyramidala nervceller i CA1 (hippocampus) av sövda möss. Detta protokoll använder adeno-associerade virus (AAV)-beroende märkning av VTA glutamat nervceller för spårning av VTA presynaptic glutamat terminaler i lagren av hippocampus. Uttryck av ljusstyrd opsin (channelrhodopsin; hChR2) och fluorescensprotein (eYFP) som hyss av AAV-vektorn tillåten anterograde spårning av VTA glutamatterminaler och fotostimulering av VTA glutamat neuroncellkroppar (i VTA). Hög impedans akut kisel elektroder var placerade i CA1 för att upptäcka multi-unit och en enhet svar på VTA fotostimulering in vivo. Resultaten av denna studie visar den lagerberoende fördelningen av presynaptiska VTA glutamat terminaler i hippocampus (CA1, CA3 och DG). Dessutom ökade fototimuleringen av VTA glutamatneuroner avfyrnings- och spränghastigheten för förmodade CA1-pyramidenheter in vivo.

Introduction

Under det senaste decenniet utvecklades en rad genetiska verktyg för att öka specificiteten hos neuron-typ modulering, och kartläggning av komplexa neurala nätverk1. Särskilt neurotropa virus med en inneboende förmåga att infektera och replikera i neuronala celler har distribuerats för att uttrycka eller brinna specifika proteiner i neuron subtyper. När man hyser fluorescensproteiner eller genetiskt kodade synaptiska aktivitetsindikatorer, transfecterade AAV vektorer etikett och avgränsa neurala nätverk över hjärnregioner2,3. Valet av en promotor i AAV-konstruktionen styr uttrycket av vektorn i neurontyper med en viss specificitetsnivå(promotorberoende uttryck). Men genom Cre-lox rekombination, AAV konstruktioner distribueras med större specificitet för neuron märkning4,5,6,7. Observera, fotoaktiverade mikrobiella opsinsiner och fluorescensproteiner förpackade i AAV vektorer kan uttryckas i olika neuron subtyper8, och är idealiska för bildbehandling, neuron-typ kretsspårning och fotomodulering9,10.

AAV konstruerar stereotaktiskt injiceras i en hjärnregion (eller kärna) driver uttrycket av reporterproteinet i soma, dendrite och axons terminaler. Neuralt uttryck av AAV som hyser en reportergen (eYFP) underlättar märkning av neuroncellkroppar och anatomisk spårning av projektioner till och från andrahjärnregioner 11,12,13,14. AAV-eYFP-konstruktioner som bär ljusstyrd opsin (t.ex. hChR2), kan användas som ett verktyg föravbildning 6,15 och stimuleringsbaserad fysiologisk spårning av neurala projektioner för att rikta in sig på hjärnområden in vivo16. Beroende på AAV-serotypen kan neuronmärkningens riktning vara anterograde eller bakåtsträvande11,12. Tidigare studier har visat att AAV5 reser anterogradely i nervceller12. Således ger fotostimulering av cellkroppar som uttrycker hChR2 presynaptiska effekter någon annanstans i hjärnan (målet)17.

Här användes AAV (serotyp 5) med en CaMKIIα promotor för att uttrycka eYFP (reporter) och hChR2 (opsin) i VTA glutamat nervceller och axonal projektioner. Resultaten från denna studie visar den lagerberoende fördelningen av VTA-glutamat presynaptiska terminaler i CA1, CA3 och DG hippocampal regioner. Dessutom ökade fotostimuleringen av VTA glutamatneuroner CA1 multi-unit och en enhet eldningshastigheter in vivo jämfört med baslinjevärden. Detta protokoll använder prisvärda verktyg och kommersiellt tillgänglig programvara som kan öka kvaliteten på data som erhållits från neurala kretsspårningsexperiment.

Protocol

Alla experimentella och djurhanteringsförfaranden godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Louisiana State University School of Veterinary Medicine. 1. Försöksdjur Använd 5–6 veckor gamla möss. Hus 3-5 djur per bur under standardförhållanden på 12 h alternerande ljus och mörk cykel. Mat och vatten bör tillhandahållas ad libitum. 2. Kraniotomi och djurberedning OBS: I det h?…

Representative Results

Spårning av anterograde AAV uttryck kontrollerades av immunofluorescens imaging av reporter protein (eYFP) i VTA av C57BL/6 möss 21 dagar efter injektion (Figur 2). Framgångsrik anterograde märkning av presynaptic VTA glutamat projektioner i hippocampus verifierades också av eYFP detektion i lagren av DG, CA3 och CA1 (Figur 6a-d; Film 2 och 3). VTA glutamatproj…

Discussion

Under det senaste decenniet har utformningen av AAV-konstruktioner utvecklats avsevärt. Som sådan har mer neuronspecifika promotors införlivats i en rad AAV serotyper för förbättrad transfection specificitet14. Genom att kombinera gener för fluorescensproteiner, transportörer, receptorer och jonkanaler finns nu bibliotek av AAV för avbildning, neuromodulering och synaptisk aktivitetsdetektering. I kommersiellt tillgängliga AAV-konstruktioner möjliggör en kombination av en genetiskt kod…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansieras av CBS Bridging Grant som tilldelas OOM. OOM, PAA och AS utformade studien och utförde experimenten. AS och PAA analyserade resultaten. OOM och PAA utarbetade manuskriptet. Vi tackar Dr. Karl Disseroth (Stanford University) för att ha gjort AAV tillgängligt för vår användning.

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
  2. Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses. Neuroscience bulletin. , 1-12 (2019).
  3. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  4. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  5. Dragatsis, I., Zeitlin, S. A method for the generation of conditional gene repair mutations in mice. Nucleic acids research. 29 (3), 10 (2001).
  6. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  7. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in cognitive sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  8. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251 (2012).
  9. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  10. Kohara, K., et al. Cell type-specific genetic and optogenetic tools reveal hippocampal CA2 circuits. Nature Neuroscience. 17 (2), 269 (2014).
  11. Gombash, S. E. Adeno-Associated Viral Vector Delivery to the Enteric Nervous System: A Review. Postdoc Journal. 3 (8), 1-12 (2015).
  12. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-Associated Viral Vectors in Neuroscience Research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
  13. Montardy, Q., et al. Characterization of glutamatergic VTA neural population responses to aversive and rewarding conditioning in freely-moving mice. Science Bulletin. 64 (16), 1167-1178 (2019).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  15. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  16. Zingg, B., et al. AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  17. Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain. Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).
  18. Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).
  19. Buzsaki, G., et al. Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics. Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).
  20. Benardo, L. S., Prince, D. A. Dopamine action on hippocampal pyramidal cells. Journal of Neuroscience. 2 (4), 415-423 (1982).
  21. Davidow, J. Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence. Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).
  22. Hu, H. Reward and Aversion. Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).
  23. Kahn, I., Shohamy, D. Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans. Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).
  24. Lisman, J. E. Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions. Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).
  25. Lisman, J. E., Grace, A. A. The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory. Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).
  26. Broussard, J. I., et al. Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus. Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).
  27. Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity. Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).
  28. Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task. Learning & Memory. 21 (2), 61-72 (2014).
  29. Ntamati, N. R., Luscher, C. VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus. eNeuro. 3 (4), (2016).
  30. Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 13697 (2016).
  31. Funahashi, S. Working Memory in the Prefrontal Cortex. Brain Sciences. 7 (5), (2017).
  32. Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area. Science. 333 (6040), 353-357 (2011).
  33. McNamara, C. G., Dupret, D. Two sources of dopamine for the hippocampus. Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).
  34. McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence. Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).
  35. Cardin, J. A., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).
  36. Mei, Y., Zhang, F. Molecular tools and approaches for optogenetics. Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).
  37. Zingg, B., et al. AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors. Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).
  38. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).
  39. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  40. Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. Two-photon optogenetics. Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).

Tags

In Vivo TracingVentral Tegmental AreaGlutamate TerminalsHippocampusOptogeneticsStereotaxic SurgeryExtracellular RecordingAdeno-associated VirusNeurocircuitsNeural Pathways

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image