Summary

Mikrovezikül ve Ekzozomların Kağıt Bazlı Preconcentration ve İzolasyonları

Published: April 29, 2020
doi:

Summary

Sunulan mikroveziküller ve ekzozomların etkili zenginleşmesi ve izolasyonu için kağıt tabanlı bir cihaz imal etmek için bir protokoldür.

Abstract

Mikroveziküller ve ekzozomlar hücre dışı ortama salınan ve vücutta dolaşan küçük membranöz veziküllerdir. DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler gibi çeşitli ebeveyn hücre kaynaklı biyomoleküller içerdikleri için, bunların zenginleşmesi ve izolasyonu klinik uygulamalar için potansiyel biyobelirteçler olarak sömürülmeleri için kritik adımlardır. Ancak, konvansiyonel izolasyon yöntemleri (örn. ultrasantrifüj) mikrovezikülve ekzozomlarda önemli kayıp ve hasara neden olur. Bu yöntemler aynı zamanda aşırı santrifüj, yükleme ve reaktiflerin israfı birden çok tekrarlayan adımlar gerektirir. Bu makalede, basit bir şekilde mikroveziküllerin ve ekzozomların etkili bir şekilde zenginleştirilmesi ve izole edilmesi için tasarlanmış bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) imal etmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Yakınsak örnek alana sahip akordeon benzeri çok katlı katmanlardan oluşan Exo-PAD’in benzersiz tasarımı, iyon konsantrasyonu polarizasyon tekniği ile entegre edilerek mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleştirilmesine olanak sağlar. Buna ek olarak, zenginleştirilmiş mikroveziküller ve ekzozomlar sadece Exo-PAD açArak izole edilir.

Introduction

Mikroveziküller ve ekzozomlar sırasıyla 0.2−1 μm ve 30−200 nm ölçülerinde küçük membran veziküllerdir. Onlar birkaç farklı hücre tipleri 1 tarafından hücre dışı ortama salgılanır1,2,3,4,5. Onlar DNA, mRNA, miRNA, proteinler ve lipidler alt kümeleri şeklinde ebeveyn hücre bilgileri içerir ve serum, plazma, idrar, beyin-omurilik sıvısı, amniyotik sıvı ve tükürük gibi çeşitli vücut sıvıları ile vücutta dolaşan6,7,8,9. Bu nedenle, mikroveziküllerin ve ekzozomların biyolojik sıvılardan verimli bir şekilde izole edilmesi ne kadar iyi olursa odalabilmek için, hastalığın tanı, prognoz ve gerçek zamanlı izleme ve yeni tedavi alanlarının geliştirilmesi alanlarında geniş fırsatlar sunabilmektedir.

Ancak, ultrasantrifüje dayalı mikroveziküller ve ekzozomlar için geleneksel izolasyon yöntemi son derece zaman alıcıdır ve numunenin önemli ölçüde kaybolmasına ve kirlenmesine neden olur. Birkaç hantal pipetleme ve yükleme adımları ve tekrarlanan ultracentrifugation,5,6,10,11,12ile çeşitli reaktiflerin atılması içerir olmasıdır.12 Ayrıca, ultracentrifugation tarafından indüklenen yüksek kesme stresi (~ 100.000 x g)mikrovezikülve ekzozomların fiziksel lysis neden olabilir, kötü iyileşme oranları verim (%5−23%)6,13,14. Bu nedenle, mikroveziküller ve ekzozomlar için son derece verimli, göze batmaz bir izolasyon tekniği geliştirilmeli, böylece daha yüksek iyileşme oranları elde edilmelidir.

Bir origami-kağıt tabanlı cihaz (Exo-PAD) mikroveziles ve ekzozomlar6basit, nazik ve yüksek verimli izolasyon için geliştirilmiştir. Exo-PAD’in tasarımı, seri olarak bağlı numune alanlarına sahip ve çapı giderek azalan çok katlı bir kağıttır. Yüklü biyomolekülleri önceden yoğunlaştıran nano-elektrokinetik bir fenomen olan iyon konsantrasyonu polarizasyon (ICP) tekniği bu eşsiz tasarımla bütünleşmiştir. Exo-PAD’in kullanılması, mikroveziküllerin ve ekzozomların belirli katmanlarda beş kat zenginleşmesine ve cihazın sadece açığa çıkarılarak izolasyonuna yol açtı. Bu makalede, exo-PAD ayrıntılı olarak açıklanır, genel cihaz imalatı ve operasyon kullanımının analizi, yöntemi göstermek ve temsili sonuçları göstermekiçin 6.

Protocol

1. Cihaz imalatı Yazıcı yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak kağıda basılacak bölgeyi tanımlayın.NOT: Tasarım, dairesel numune alanlarının çaplarının kademeli olarak 5 mm’den 2 mm’ye kadar daraldığı 12 balmumu desenli katmana sahiptir(Şekil 1A). Selüloz kağıdın her iki tarafına belirlenen bölgelere hidrofobik balmumu yazdırın(Malzeme Tablosu) ticari balmumu yazıcı(Malzeme Tablosu)<str…

Representative Results

İşlem süresi zenginleştirilmiş mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum geri kazanım verimini elde etmek için optimize edilmelidir. Yetersiz zaman mikroveziküllerin ve ekzozomların yeterli göçetmesine izin vermez, bu da zenginleştirmeyi azaltır, aşırı zaman ise uzamsal odaklamayı bozar ve dolayısıyla mikrovezikülleri ve ekzozomları dağıtır. Böylece, zaman optimizasyonu adımı ile mikroveziküllerin ve ekzozomların maksimum ön konsantrasyon faktörü ve mikroveziküllerin ve ekzozomların e…

Discussion

Exo-PAD mikroveziküllerin ve ekzozomların zenginleşmesi ve izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılmasına rağmen, birkaç kritik nokta dikkatle düşünülmelidir: 1) cihaz hazırlama sırasında fırın kuluçka süresi ve sıcaklığı, 2) işlem süresi, 3) değişen katman numaraları ve örnek alan çapları ile gerilim uygulaması ve 4) klinik numunelere uygulanabilirlik.

Protokolde verilen kuluçka süresi ve sıcaklığı, güvenilir bir cihaz imal etmek için optimize …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Kore Ulusal Araştırma Vakfı Grant NRF-2018R1D1A1A09084044 tarafından desteklenmiştir. J. H. Lee, 2019 yılında Kwangwoon Üniversitesi’nden bir araştırma bursu ile desteklenmiştir. Hyerin Kim, Kore Ticaret, Sanayi ve Enerji Bakanlığı’nın (MOTIE) Kore Teknoloji Geliştirme Enstitüsü (KIAT) tarafından işletilen “Endüstri Uzmanları için Yetkinlik Geliştirme Programı” tarafından desteklendi. P0002397, Giyilebilir Akıllı Cihazların Endüstriyel Yakınsaması için HRD programı).

Materials

Ag/AgCl electrodes A-M Systems, Inc. 531500 0.15" diameter
Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific A13101 BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm)
Carbonate-Bicarbonate Buffer Sigma-Aldrich C3041-50CAP Carbonate buffer
CorelDraw software (Coral Co., Canada) Corel Corporation Printer software to define wax printing region
ColorQube 8870 Xerox Corporation Wax printer
Chromatography paper grade 1 Whatman 3001-861 Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm
Fluorescent-labeled exosome standards HansaBioMed Life Sciences, Ltd. HBM-F-PEP-100 Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 current/voltage source-meter Keithley Instruments, Inc. Current–voltage source measurement system
Nafion perfluorinated resin solution Sigma-Aldrich 31175-20-9 Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water
NanoSight LM10 NanoSight Technology Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine
Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) Thermo Fisher Scientific 10010001

References

  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
  3. Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
  4. Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
  5. Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
  6. Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
  7. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  8. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
  9. Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
  10. Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
  11. Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  12. Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
  13. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
  14. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  15. Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
  16. Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).

Play Video

Cite This Article
Lee, D., Wee, K. W., Kim, H., Han, S. I., Kwak, S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Paper-Based Preconcentration and Isolation of Microvesicles and Exosomes. J. Vis. Exp. (158), e61292, doi:10.3791/61292 (2020).

View Video