Måling af Post-Stroke Cerebral Ødem, Infarct Zone og Blod-Brain Barrier Opdeling i et enkelt sæt gnaver Hjerne Prøver
Summary
Denne protokol beskriver en ny teknik til måling af de tre vigtigste parametre for iskæmisk hjerneskade på samme sæt gnaver hjerneprøver. Det er meget fordelagtigt kun at bruge én hjerneprøve med hensyn til etiske og økonomiske omkostninger.
Abstract
En af de mest almindelige årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan er iskæmisk slagtilfælde. Historisk set, et dyr model, der anvendes til at stimulere iskæmisk slagtilfælde indebærer midten cerebral arterie okklusion (MCAO). Infarkt zone, hjerneødem og blod-hjerne barriere (BBB) opdeling måles som parametre, der afspejler omfanget af hjerneskade efter MCAO. En væsentlig begrænsning af denne metode er, at disse målinger normalt opnås i forskellige rottehjerneprøver, hvilket fører til etiske og økonomiske byrder på grund af det store antal rotter, der skal aflives for en passende prøvestørrelse. Her præsenterer vi en metode til præcist at vurdere hjerneskade efter MCAO ved at måle infarkt zone, hjerneødem og BBB permeabilitet i samme sæt rottehjerner. Denne nye teknik giver en mere effektiv måde at evaluere patofysiologi af slagtilfælde.
Introduction
En af de mest almindelige årsager til sygelighed og dødelighed på verdensplan er slagtilfælde. Globalt repræsenterer iskæmisk slagtilfælde 68% af alle slagtilfælde tilfælde, mens der i USA iskæmisk slagtilfælde tegner sig for 87% af slagtilfælde tilfælde1,2. Det anslås , at den økonomiske byrde ved slagtilfælde når op på34 mia. Dyremodeller af slagtilfælde er nødvendige for at studere sin patofysiologi, udvikle nye metoder til evaluering og foreslå nye terapeutiske muligheder4.
Iskæmisk slagtilfælde opstår med okklusion af en større cerebral arterie, normalt den midterste cerebral arterie eller en af dens grene5. Således modeller af iskæmisk slagtilfælde har historisk involveret midten cerebral arterie okklusion (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. Efter MCAO, neurologisk skade vurderes oftest ved at måle infarktzone (IZ) ved hjælp af en farvningsmetode på 2,3,5-triphenylenrazoliumchlorid (TTC)13, hjerneødem (BE) ved hjælp af tørring eller beregning af halvkugleformet volumen14,15,16og bbb-permeabilitet (blood brain barrier) ved hjælp af en spektrometriteknik ved hjælp af Evans blå farvning17,18,19.
Den traditionelle MCAO-metode bruger separate sæt hjerner til hver af de tre hjernemålinger. For en stor stikprøvestørrelse resulterer dette i et betydeligt antal aflivede dyr med yderligere etiske og økonomiske overvejelser. En alternativ metode til at lette disse omkostninger ville indebære målinger af alle tre parametre i et enkelt sæt af post-MCAO gnaver hjerner.
Tidligere forsøg er blevet gjort for at måle kombinationer af parametre i samme hjerneprøve. Samtidige immunfluorescerende farvningsmetoder20 samt andre molekylære og biokemiske analyser21 er blevet beskrevet efter TTC-farvning i samme hjerneprøve. Vi har tidligere beregnet hjernehalvdel mængder til at vurdere hjernen ødem og udført TTC farvning til at beregne infarkt zone i samme hjerne sæt15.
I denne protokol præsenterer vi en modificeret MCAO-teknik, der måler iskæmisk hjerneskade ved at bestemme IZ, BE og BBB permeabilitet i det samme sæt gnaverhjerner. IZ måles ved TTC-farvning, BE bestemmes ved beregning af halvkugleformet volumen, og BBB-permeabilitet opnås ved spektrometrimetoder19. I denne protokol brugte vi en modificeret MCAO-model, baseret på direkte indsættelse og fiksering af monofilamentkateteret i den indre halspulsåre (ICA) og yderligere blokering af blodgennemstrømningen til den midterste cerebral arterie (MCA)22. Denne ændrede metode viser en nedsat dødelighed og sygelighed sammenlignet med den traditionelle MCAO-metode16,22.
Denne nye tilgang giver en økonomisk sund og etisk model til måling af neurologiske skader efter MCAO. Denne vurdering af de vigtigste parametre for iskæmisk hjerneskade vil bidrage til en omfattende undersøgelse af dens patofysiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hovedformålet med denne protokol var at påvise konsekvente målinger af tre hovedparametre for iskæmisk skade: IZ, BE og BBB permeabilitet. Tidligere undersøgelser på dette område har vist muligheden for at udføre en eller to af disse parametre sammen i samme stikprøve. Ud over den omkostningsreduktion, som denne tredelte metode tilbyder, giver den også en mere ønskelig bioetisk model, der begrænser antallet af dyr, der skal opereres på og efterfølgende aflives. Som i alle histologiske teknikker er metoden b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko og Evgenia Goncharyk fra Institut for Fysiologi, Det Biologiske Fakultet, Økologi og Medicin, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Ukraine for deres støtte og nyttige bidrag til vores drøftelser. De indhentede data er en del af Ruslan Kuts’ ph.d.-afhandling.
Materials
| 2 mL Syringe | Braun | 4606027V | |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | Sigma-Aldrich | 500 cc | Provides general antisepsis of the skin in the operatory field |
| 27 G Needle with Syringe | Braun | 305620 | |
| 3-0 Silk sutures | Henry Schein | 1007842 | |
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Brain & Tissue Matrices | Sigma-Aldrich | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 183603985447 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | Sigma-Aldrich | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | Sigma-Aldrich | HR-AZ/HR-A | |
| Digital weighing scale | Sigma-Aldrich | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | EP0030119460 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | Model: Infinite 200 PRO multimode reader | Optional. |
| Fluorescence detector | Molecular Devices LLC | VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument | Optional. |
| Gauze sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Hemostatic microclips | Sigma-Aldrich | ||
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Infusion cuff | ABN | IC-500 | |
| Micro forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Micro scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Multiset | Teva Medical | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | Sigma-Aldrich | ||
| Operating scissors | Sigma-Aldrich | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | Resolution 3200 x 6400 dpi |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | P5606 | |
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment. |
| Rat cages | Techniplast | 2000P | Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment |
| Scalpel blades #11 | Sigma-Aldrich | S2771 | |
| Software | |||
| Adobe Photoshop CS2 for Windows | Adobe | ||
| ImageJ 1.37v | NIH | The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | |
| Office 365 ProPlus | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Reagents | |||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | |
| Ethanol 96 % | Romical | Flammable liquid | |
| Evans blue 2% | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Isoflurane, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 |
References
- Krishnamurthi, R. V., et al. Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet Global Health. 1, 259-281 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, 146 (2017).
- Wilkins, E., et al. . European cardiovascular disease statistics 2017. , (2017).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Lloyd-Jones, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D., Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical Neurology. 24, 47-51 (1985).
- Albanese, V., Tommasino, C., Spadaro, A., Tomasello, F. A transbasisphenoidal approach for selective occlusion of the middle cerebral artery in rats. Experientia. 36, 1302-1304 (1980).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. Transorbital approach to the middle cerebral artery of the squirrel monkey: a technique for experimental cerebral infarction applicable to ultrastructural studies. Stroke. 1, 107-111 (1970).
- Waltz, A. G., Sundt, T. M., Owen, C. A. Effect of middle cerebral artery occlusion on cortical blood flow in animals. Neurology. 16, 1185-1190 (1966).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Aspey, B. S., Cohen, S., Patel, Y., Terruli, M., Harrison, M. J. Middle cerebral artery occlusion in the rat: consistent protocol for a model of stroke. Neuropathology and Applied Neurobiology. 24, 487-497 (1998).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- O’Brien, M. D., Jordan, M. M., Waltz, A. G. Ischemic cerebral edema and the blood-brain barrier. Distributions of pertechnetate, albumin, sodium, and antipyrine in brains of cats after occlusion of the middle cerebral artery. Archives of Neurology. 30, 461-465 (1974).
- Chen, C. H., Toung, T. J., Sapirstein, A., Bhardwaj, A. Effect of duration of osmotherapy on blood-brain barrier disruption and regional cerebral edema after experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26, 951-958 (2006).
- Boyko, M., et al. Establishment of Novel Technical Methods for Evaluating Brain Edema and Lesion Volume in Stroked Rats: a Standardization of Measurement Procedures. Brain Research. , (2019).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Sifat, A. E., Vaidya, B., Abbruscato, T. J. Blood-Brain Barrier Protection as a Therapeutic Strategy for Acute Ischemic Stroke. AAPS Journal. 19, 957-972 (2017).
- Jiang, X., et al. Blood-brain barrier dysfunction and recovery after ischemic stroke. Progress in Neurobiology. 163-164, 144-171 (2018).
- Belayev, L., Busto, R., Zhao, W., Ginsberg, M. D. Quantitative evaluation of blood-brain barrier permeability following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Research. 739, 88-96 (1996).
- Li, L., Yu, Q., Liang, W. Use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride-stained brain tissues for immunofluorescence analyses after focal cerebral ischemia in rats. Pathology – Research and Practice. 214, 174-179 (2018).
- Kramer, M., et al. TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses. Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).
- Kuts, R., et al. A middle cerebral artery occlusion technique for inducing post-stroke depression in rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Kuts, R., et al. A Novel Method for Assessing Cerebral Edema, Infarcted Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Post-stroke Rodent Brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
- McGarry, B. L., Jokivarsi, K. T., Knight, M. J., Grohn, O. H. J., Kauppinen, R. A. A Magnetic Resonance Imaging Protocol for Stroke Onset Time Estimation in Permanent Cerebral Ischemia. Journal of Visualized Experiments. , e55277 (2017).
- Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat. Journal of Visualized Experiments. , e1978 (2011).
- Boyko, M., et al. The effect of blood glutamate scavengers oxaloacetate and pyruvate on neurological outcome in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Neurotherapeutics. 9, 649-657 (2012).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. , e58875 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. , e3564 (2012).
- Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. Journal of Visualized Experiments. , e52675 (2015).
- . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (2018)
- Boyko, M., et al. Pyruvate’s blood glutamate scavenging activity contributes to the spectrum of its neuroprotective mechanisms in a rat model of stroke. European Journal of Neuroscience. 34, 1432-1441 (2011).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- . ImageJ, U. S. National Institutes of Health Available from: https://imagej.nih.gov/ij (1997)
- Kaplan, B., et al. Temporal thresholds for neocortical infarction in rats subjected to reversible focal cerebral ischemia. Stroke. 22, 1032-1039 (1991).
- Kumai, Y., et al. Postischemic gene transfer of soluble Flt-1 protects against brain ischemia with marked attenuation of blood-brain barrier permeability. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 27, 1152-1160 (2007).
- Schuleri, K. H., et al. Characterization of peri-infarct zone heterogeneity by contrast-enhanced multidetector computed tomography: a comparison with magnetic resonance imaging. Journal of the American College of Cardiology. 53, 1699-1707 (2009).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molecules. 24, (2019).
- Di Napoli, M. Caplan’s Stroke: A Clinical Approach. Journal of the American Medical Association. 302, 2600-2601 (2009).
- Deb, P., Sharma, S., Hassan, K. M. Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis. Pathophysiology. 17, 197-218 (2010).
- Simard, J. M., Kent, T. A., Chen, M., Tarasov, K. V., Gerzanich, V. Brain oedema in focal ischaemia: molecular pathophysiology and theoretical implications. Lancet Neurology. 6, 258-268 (2007).
- Klatzo, I. Pathophysiological aspects of brain edema. Acta Neuropathology. 72, 236-239 (1987).
- Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42, 3323-3328 (2011).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Liu, C., et al. Increased blood-brain barrier permeability in contralateral hemisphere predicts worse outcome in acute ischemic stroke after reperfusion therapy. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10, 937-941 (2018).
- Boyko, M., et al. Establishment of novel technical methods for evaluating brain edema and lesion volume in stroked rats: A standardization of measurement procedures. Brain Research. 1718, 12-21 (2019).
