Mesure de l’œdème cérébral post-AVC, de la zone infarctus et de la dégradation de la barrière céphalo-cérébrale dans un seul ensemble d’échantillons de cerveaux de rongeurs

Summary

Ce protocole décrit une nouvelle technique de mesure des trois paramètres les plus importants des lésions cérébrales ischémiques sur le même ensemble d’échantillons de cerveau de rongeurs. L’utilisation d’un seul échantillon de cerveau est très avantageuse en termes de coûts éthiques et économiques.

Abstract

L’une des causes les plus courantes de morbidité et de mortalité dans le monde est l’AVC ischémique. Historiquement, un modèle animal utilisé pour stimuler l’AVC ischémique implique l’occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO). La zone infarctus, l’oedème cérébral et la dégradation de la barrière céphalo-cérébrale (BBB) sont mesurés comme paramètres qui reflètent l’étendue des lésions cérébrales après mcao. Une limitation significative à cette méthode est que ces mesures sont normalement obtenues dans différents échantillons de cerveau de rat, menant aux fardeaux éthiques et financiers dus au grand nombre de rats qui doivent être euthanasiés pour une taille appropriée d’échantillon. Ici nous présentons une méthode pour évaluer avec précision des dommages de cerveau suivant MCAO en mesurant la zone d’infarctus, l’oedème de cerveau et la perméabilité de BBB dans le même ensemble de cerveaux de rat. Cette nouvelle technique fournit un moyen plus efficace d’évaluer la pathophysiologie de l’AVC.

Introduction

L’une des causes les plus courantes de morbidité et de mortalité dans le monde est l’AVC. À l’échelle mondiale, l’AVC ischémique représente 68 % de tous les cas d’AVC, tandis qu’aux États-Unis, l’AVC ischémique représente 87 %^{des cas d’AVC 1,2}. On estime que la charge économique de l’AVC atteint 34 milliards de dollars aux États-Unis^{2 et} 45 milliards d’euros dans l’Union européenne³. Des modèles animaux d’AVC sont nécessaires pour étudier sa pathophysiologie, développer de nouvelles méthodes d’évaluation et proposer de nouvelles options thérapeutiques⁴.

La course ischémique se produit avec l’occlusion d’une artère cérébrale principale, habituellement l’artère cérébrale moyenne ou une de ses branches^5. Ainsi, les modèles de course ischémique ont historiquement impliqué l’occlusion cérébrale moyenne d’artère (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12.} Après mcao, les dommages neurologiques sont le plus généralement évalués en mesurant la zone infarctus (IZ) utilisant une méthode de coloration de chlorure de chlorure de 2,3,5 triphenyltetrazolium (TTC)^13,oedème cérébral (BE) utilisant séchage ou calcul des volumes hémisphériques^14,15,16, et la perméabilité de la barrière hémique du sang (BBB) par une technique de spectrométrie utilisant la coloration bleue Evans^17,18,19.

La méthode MCAO traditionnelle utilise des ensembles distincts de cerveaux pour chacune des trois mesures du cerveau. Pour un échantillon de grande taille, il en résulte un nombre important d’animaux euthanasiés, avec des considérations éthiques et financières supplémentaires. Une autre méthode pour atténuer ces coûts impliquerait des mesures des trois paramètres dans un seul ensemble de cerveaux rongeurs post-MCAO.

Des tentatives antérieures ont été faites pour mesurer les combinaisons de paramètres dans le même échantillon de cerveau. Des méthodes de coloration immunofluorescentes^{simultanées 20} ainsi que d’autres analyses moléculaires et^{biochimiques 21 ont} été décrites après coloration de TTC dans le même échantillon de cerveau. Nous avons précédemment calculé des volumes d’hémisphère de cerveau pour évaluer l’oedème de cerveau et avons exécuté la coloration de TTC pour calculer la zone infarctus dans le même ensemble^{de cerveau 15.}

Dans le présent protocole, nous présentons une technique modifiée de MCAO qui mesure des dommages ischémiques de cerveau en déterminant la perméabilité d’IZ, de BE, et de BBB dans le même ensemble de cerveaux de rongeur. IZ est mesurée par coloration TTC, BE est déterminé par le calcul du volume hémisphérique, et la perméabilité BBB est obtenue par des méthodes de spectrométrie¹⁹. Dans ce protocole, nous avons employé un modèle modifié de MCAO, basé sur l’insertion directe et la fixation du cathéter monofilament dans l’artère carotide interne (ICA) et le blocage supplémentaire du flux sanguin à l’artère cérébrale moyenne (MCA)^22. Cette méthode modifiée montre une diminution du taux de mortalité et de morbidité par rapport à la méthode mcao^{traditionnelle 16,22}.

Cette nouvelle approche fournit un modèle financièrement sain et éthique pour mesurer les lésions neurologiques après l’AMC. Cette évaluation des principaux paramètres des lésions cérébrales ischémiques aidera à étudier en profondeur sa pathophysiologie.

Protocol

Les procédures suivantes ont été menées conformément aux recommandations de la Déclaration d’Helsinki et de Tokyo et aux Lignes directrices pour l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont également été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben Gourion du Néguev. 1. Préparation des rats à la procédure expérimentale Sélectionnez des rats sprague-dawley mâles adultes sans pathologie géné…

Representative Results

Mesure de la zone infarctus Un t-test indépendant a indiqué que 19 rats qui ont subi mcao permanent ont démontré une augmentation significative du volume d’infarctus de cerveau comparé aux 16 rats sham-operated (MCAO=7.49% ± 3.57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (voir figure 2A)). Les données sont exprimées en pourcentage moyen de l’hémisphère contralatéral ± SD. <stro…

Discussion

L’objectif principal du présent protocole était de démontrer des mesures cohérentes de trois paramètres principaux des lésions ischémiques : la perméabilité de l’IZ, du BE et du BBB. Des études antérieures dans ce domaine ont démontré la possibilité d’effectuer un ou deux de ces paramètres ensemble dans le même échantillon. Outre la réduction des coûts que cette méthode en trois parties offre, elle fournit également un modèle bioéthique plus souhaitable qui limite le nombre d’animaux qui do…

Materials

2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	–	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017