Måling av post-stroke cerebralt ødem, infarktsone og blod-hjernebarrieresammenbrudd i ett enkelt sett med gnagerhjerneprøver

Summary

Denne protokollen beskriver en ny teknikk for å måle de tre viktigste parametrene for iskemisk hjerneskade på samme sett med gnagerhjerneprøver. Bruk av bare én hjerneprøve er svært fordelaktig når det gjelder etiske og økonomiske kostnader.

Abstract

En av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden er iskemisk slag. Historisk, en dyremodell som brukes til å stimulere iskemisk slag innebærer midten cerebral arterie okklusjon (MCAO). Infarct sone, hjerneødem og blod-hjernebarriere (BBB) sammenbrudd måles som parametere som gjenspeiler omfanget av hjerneskade etter MCAO. En betydelig begrensning til denne metoden er at disse målingene normalt oppnås i forskjellige rottehjerneprøver, noe som fører til etiske og økonomiske byrder på grunn av det store antallet rotter som må eutaniseres for en passende prøvestørrelse. Her presenterer vi en metode for å nøyaktig vurdere hjerneskade etter MCAO ved å måle infarct sone, hjerneødem og BBB permeabilitet i samme sett av rottehjerner. Denne nye teknikken gir en mer effektiv måte å evaluere patofysiologien til hjerneslag.

Introduction

En av de vanligste årsakene til sykelighet og dødelighet over hele verden er hjerneslag. Globalt representerer iskemisk slag 68% av alle slagtilfeller, mens i USA står iskemisk slag for 87% av hjerneslagtilfeller^1,2. Det er anslått at den økonomiske byrden av hjerneslag når $ 34 milliarder i USA² og € 45 milliarder i EU³. Dyremodeller av hjerneslag er nødvendig for å studere sin patofysiologi, utvikle nye metoder for evaluering, og foreslå nye terapeutiske alternativer⁴.

Iskemisk slag oppstår med okklusjon av en stor cerebral arterie, vanligvis den midterste hjernearterien eller en av dens grener⁵. Dermed har modeller av iskemisk slag historisk involvert midten cerebral arterie okklusjon (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. Etter MCAO, nevrologisk skade vurderes oftest ved å måle infarktsone (IZ) ved hjelp av en 2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid (TTC) fargingsmetode¹³, hjerneødem (BE) ved hjelp av tørking eller beregning av hemisfæriske volumer^14,15,16,og blod hjernebarriere (BBB) permeabilitet av en spektrometri teknikk ved hjelp av Evans blå flekker^17,18,19.

Den tradisjonelle MCAO-metoden bruker separate sett med hjerner for hver av de tre hjernemålingene. For en stor utvalgsstørrelse resulterer dette i et betydelig antall eutaniserte dyr, med ekstra etiske og økonomiske hensyn. En alternativ metode for å lindre disse kostnadene ville innebære målinger av alle tre parametrene i et enkelt sett med post-MCAO gnagerhjerner.

Tidligere forsøk er gjort for å måle kombinasjoner av parametere i samme hjerneprøve. Samtidige immunofluorescerende fargingsmetoder²⁰ samt andre molekylære og biokjemiske analyser²¹ har blitt beskrevet etter TTC-farging i samme hjerneprøve. Vi har tidligere beregnet hjernehalvkulevolumer for å vurdere hjerneødem og utført TTC-farging for å beregne infarktsone i samme hjernesett¹⁵.

I den nåværende protokollen presenterer vi en modifisert MCAO-teknikk som måler iskemisk hjerneskade ved å bestemme IZ, BE og BBB permeabilitet i samme sett med gnagerhjerner. IZ måles ved TTC-farging, BE bestemmes ved å beregne hemisfært volum, og BBB permeabilitet oppnås ved spektrometrimetoder¹⁹. I denne protokollen brukte vi en modifisert MCAO-modell, basert på direkte innsetting og fiksering av monofilamentkateteret i den indre halspulsåren (ICA) og ytterligere blokkering av blodstrømmen til den midterste hjernearterien (MCA)²². Denne modifiserte metoden viser en redusert dødelighet og sykelighet sammenlignet med den tradisjonelle MCAO-metoden^16,22.

Denne nye tilnærmingen gir en økonomisk forsvarlig og etisk modell for måling av nevrologisk skade etter MCAO. Denne vurderingen av de viktigste parametrene for iskemisk hjerneskade vil bidra til å undersøke sin patofysiologi grundig.

Protocol

Følgende prosedyrer ble utført i henhold til anbefalingene fra Helsingfors- og Tokyo-erklæringen og retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr i Det europeiske fellesskap. Eksperimentene ble også godkjent av Dyrevernskomiteen ved Ben-Gurion University of the Negev. 1. Klargjør rotter for eksperimentell prosedyre Velg voksne hann Sprague-Dawley rotter uten overt patologi, hver veier mellom 300 og 350 g. Opprettholde alle rotter ved romtemperatur ved 22 °C, med 12 …

Representative Results

Måling av infarktsone En uavhengig t-test med en uavhengig prøve indikerte at 19 rotter som gjennomgikk permanent MCAO viste en signifikant økning i hjernens infarktvolum sammenlignet med de 16 sham-opererte rotter (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31 % ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (se figur 2A)). Dataene uttrykkes som en gjennomsnittlig prosentandel av den kontralaterale halvkule ± SD. <stro…

Discussion

Hovedmålet med den nåværende protokollen var å demonstrere konsistente målinger av tre hovedparametere for iskemisk skade: IZ, BE og BBB permeabilitet. Tidligere studier på dette feltet har vist muligheten for å utføre en eller to av disse parametrene sammen i samme utvalg. Foruten kostnadsreduksjonen som denne tredelte metoden tilbyr, gir den også en mer ønskelig bioetisk modell som begrenser antall dyr som må opereres på og deretter eutaniseres. Som i alle histologiske teknikker er metoden begrenset av mang…

Materials

2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
Office 365 ProPlus	Microsoft	–	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017