Dobbelt direkte injektion af blod i Cisterna Magna som en model af Subarachnoid Blødning

Summary

Vi beskrev i denne protokol en standardiseret subaraknoid blødning (SAH) mus model ved en dobbelt injektion af autologt fuldblod i cisterna magna. Den høje grad af standardisering af dobbelt-injektion procedure repræsenterer en midt-til-akut model af SAH med relativ sikkerhed med hensyn til dødelighed.

Abstract

Blandt slagtilfælde, subaraknoid blødning (SAH) i træk til brud på en cerebral arteriel aneurisme udgør 5-9%, men er ansvarlig for omkring 30% af den samlede slagtilfælde-relaterede dødelighed med en vigtig sygelighed i form af neurologiske resultat. En forsinket cerebral vasospasme (CVS) kan forekomme oftest i forbindelse med en forsinket cerebral iskæmi. Forskellige dyremodeller af SAH anvendes nu, herunder endovaskulær perforering og direkte injektion af blod i cisterna magna eller endda den præchiasmatiske cisterne, der hver udviser forskellige fordele og ulemper. I denne artikel præsenteres en standardiseret musemodel af SAH ved dobbelt direkte injektion af bestemte mængder autologt fuldblod i cisterna magna. Kort, mus blev vejet og derefter bedøvet ved isofluran indånding. Derefter blev dyret placeret i en tilbagelænet position på et opvarmet tæppe, der fastholdt en rektal temperatur på 37 °C og placeret i en stereotaktisk ramme med en livmoderhalslig bøjning på ca. 30°. Når den var på plads, blev spidsen af en aflang glasmikropipette fyldt med det homologe arteriel blod taget fra halspulsåren af en anden mus af samme alder og køn (C57Bl/6J) placeret i en ret vinkel i kontakt med atlanto-occipitalmembranen ved hjælp af en mikropulmaniator. Derefter blev der injiceret 60 μL blod i cisternamagen efterfulgt af en 30° nedadgående hældning af dyret i 2 minutter. Den anden infusion af 30 μL blod i cisterna magna blev udført 24 timer efter den første. Den individuelle opfølgning af hvert dyr udføres dagligt (omhyggelig vurdering af vægt og velvære). Denne procedure giver mulighed for en forudsigelig og meget reproducerbar fordeling af blod, sandsynligvis ledsaget af intrakraniel trykhøjde, der kan efterlignes ved en tilsvarende injektion af en kunstig cerebral spinalvæske (CSF), og repræsenterer en akut til mild model af SAH inducerende lav dødelighed.

Introduction

Subaraknoid blødning (SAH) tegner sig for op til 5% af alle slagtilfælde tilfælde og udgør en forholdsvis almindelig patologi med en forekomst af 7,2 til 9 patienter pr 100.000 om året, med en dødelighed på 20% -60% afhængigt af undersøgelsen^1,2,3. I den akutte fase skyldes dødeligheden sværhedsgraden af blødning, rebleeding, cerebral vasospasme (CVS) og/eller medicinske komplikationer⁴. Hos overlevende, tidlig hjerneskade (EBI) er forbundet med parenkymal forlængelse af blødning og brat stigning i intrakranielt tryk, hvilket kan resultere i primær cerebral iskæmi⁵ og øjeblikkelig død i omkring 10% -15% af^{tilfældene 6}. Efter den indledende “akutte” fase af SAH afhænger prognosen af forekomsten af “sekundær” eller forsinket cerebral iskæmi (DCI), påvist hos næsten 40% af patienterne ved cerebral computertomografi, og hos op til 80% af patienterne efter magnetisk resonansscanning (MRI)^7,8. Ud over CVS forekommer mellem 4 til 21 dage efter aneurisme brud i et flertal af SAH patienter, DCI⁹ kan skyldes multifaktorielle diffuse hjernelæsioner sekundære til mikrothrombose dannelse, reduceret cerebral perfusion, neuroinflammation, og kortikal spredning depression (CSD)^10,11,12,13. Dette påvirker 30% af SAH overlevende og påvirker kognitive funktioner, herunder visuel hukommelse, verbal hukommelse, reaktionstid, og udøvende, visuospatial og sprogfunktioner¹⁴ forringer dagligdagen¹⁵. Nuværende standard behandlinger for at forhindre CVS og / eller de dårlige kognitive resultater hos SAH patienter er baseret på blokering af Ca^{2 +} signalering og vasokonstriktion ved hjælp af Ca^{2 +} kanal hæmmere som Nimodipin. Men, nyere kliniske forsøg rettet mod vasokonstriktion afslørede dissociation mellem patientens neurologiske resultat og forebyggelse af CVS¹⁶, hvilket tyder på mere komplekse patofysiologiske mekanismer, der er involveret i SAH-langsigtede konsekvenser. Derfor er der et medicinsk behov for større forståelse af antallet af patologiske hændelser, der ledsager SAH og udviklingen af gyldige og standardiserede dyremodeller for at teste originale terapeutiske indgreb.

Bruddet af en intrakraniel aneurisme mest ansvarlig for SAH hos mennesker er sandsynligvis vanskeligt at efterligne i prækliniske dyremodeller. I øjeblikket aneurisme brud og SAH situation kan forsøgsvis testes ved perforering af den midterste cerebral arterie (endovaskulær punktering model) ansvarlig for CVS og sensitivomotoriske dysfunktioner i mus^17,18. På grund af den manglende mulige kontrol over blødningsdebut og udbredelsen af blod i denne model er der udviklet andre metoder hos gnavere til at generere SAH-modeller uden endovaskulære brud. Mere præcist, de består af direkte administration af arteriel blod i subaraknoid rummet gennem en enkelt eller en dobbelt injektion i magna cisterna¹⁹ eller en enkelt injektion i prechiasmatic cisterne²⁰. Den største fordel ved disse musemodeller uden endovaskulære brud er muligheden for reproducerbart at mestre den kirurgiske procedure og kvaliteten og kvantiteten af den injicerede blodprøve. En anden fordel ved denne model i forhold til modellen ved endovaskulær perforering i særdeleshed er bevarelsen af dyrets generelle velfærd. Som en kendsgerning, denne operation er mindre invasive og teknisk mindre udfordrende end det, der kræves for at generere en carotis væg brud. I denne sidste model skal dyret intuberet og mekanisk ventileres, mens en monofilament indsættes i den eksterne halspulsåre og rykkes ind i den interne halspulsåre. Dette fører sandsynligvis til forbigående iskæmi på grund af fartøj obstruktion af tråden sti. Derfor er den co-morbiditet (døende tilstand, vigtig smerte og død) forbundet med kirurgi mindre vigtigt i dobbelt injektion model sammenlignet med endovaskulær perforering model. Ud over at være en mere konsekvent SAH er metoden med direkte indsprøjtning i overensstemmelse med dyrevelfærden inden for forskning og testning (nedsat tid under anæstesi, smerter fra vævsforstyrrelser i kirurgi og angst) og fører til et samlet minimum af dyr, der anvendes til protokolundersøgelsen og personaleuddannelsen.

Desuden giver dette mulighed for gennemførelse af den samme protokol til transgene mus, hvilket fører til en optimeret patologisk forståelse af SAH og muligheden for sammenlignende test af potentielle terapeutiske forbindelser. Her præsenterer vi en standardiseret musemodel af subaraknoid blødning (SAH) ved en dobbelt daglig injektion i træk af autolog arterielt blod i cisterna magna i 6-8 uger gamle mandlige C57Bl/6J mus. Den største fordel ved denne model er kontrol af blødningsvolumen sammenlignet med endovaskulær perforering model, og styrkelsen af blødningen begivenhed uden en drastisk stigning i intrakranielt tryk²¹. For nylig er den dobbelte direkte injektion af blod i cisterna magna blevet godt beskrevet på de eksperimentelle og fysiopatologiske spørgsmål i mus. Faktisk har vi for nylig vist CVS af store cerebrale arterier (basilar (BA), midten (MCA) og forreste (ACA) cerebrale arterier), cerebrovaskulær fibrin deposition og celle apoptose fra dag 3 (D3) til 10 (D10), cirkulation defekter af paravascular cerebrospinalvæske ledsaget af ændret sensitivomotor og kognitive funktioner i mus, 10 dage efter SAH i denne model²². Således gør det denne model mestret, valideret og karakteriseret for kortsigtede og langvarige begivenheder post-SAH. Det bør være ideelt egnet til fremadrettet identifikation af nye mål og til undersøgelser af potente og effektive terapeutiske strategier mod SAH-associerede komplikationer.

Protocol

Alle procedurer blev udført under H. Castels tilsyn i overensstemmelse med det franske etiske udvalg og retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU og Rådet for Beskyttelse af Dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Dette projekt blev godkendt af det lokale CENOMEXA og de nationale etiske komitéer for dyreforskning og -afprøvning. Mandlige C57Bl/6J Rj mus (Janvier), i alderen 8-12 uger, blev anbragt under kontrollerede standard miljøforhold: 22 °C ± 1 °C, 12 timer/12 timer lys / mørk cyklus,…

Representative Results

Eksperimentel tidsplan, procedure, opfølgning og dødelighedFigur 1A og figur 1B opsummerer SAH-modelprotokollen ved dobbelt intrakisternal blodinjektion. Kort sagt, på den første dag i SAH induktion (D-1), 60 μL blod trukket fra en homolog mus eller 60 μL kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) blev injiceret i cisterna magna i SAH eller fingeret betingelser, henholdsvis. Den næste dag (D0), blev der injiceret 30 μL blod, der blev trukket…

Discussion

På trods af intensiteten af forskningen inden for SAH og udviklingen af terapeutiske strategier såsom endovaskulære og farmakologiske behandlingsmuligheder stigende i løbet af de sidste tyve år, dødeligheden er fortsat høj inden for den første uge af hospitalsindlæggelse og når omkring 50% i løbet af de følgende 6 måneder^24,25. Denne nuværende prækliniske model ved daglig dobbelt injektion af homolog arterielt blod i cisterna magna…

Materials

absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071