Double injection directe de sang dans la Cisterna Magna comme modèle d’hémorragie subarachnoïde

Summary

Nous avons décrit dans ce protocole un modèle normalisé d’hémorragie sous-rachnoïde (SAH) de souris par une double injection de sang entier autologue dans la magna de cisterna. Le degré élevé de normalisation de la procédure de double injection représente un modèle moyen à aigu de SAH avec une sécurité relative en ce qui concerne la mortalité.

Abstract

Parmi les accidents vasculaires cérébraux, l’hémorragie subarachnoïde (SAH) consécutive à la rupture d’un anévrisme artériel cérébral représente 5-9% mais est responsable d’environ 30% de la mortalité totale liée à l’AVC avec une morbidité importante en termes de résultats neurologiques. Un vasospasme cérébral retardé (CVS) peut se produire le plus souvent en association avec une ischémie cérébrale retardée. Différents modèles animaux de SAH sont maintenant utilisés, y compris la perforation endovasculaire et l’injection directe de sang dans la cisterna magna ou même la citerne préchiasmatique, chacun présentant des avantages et des inconvénients distincts. Dans cet article, un modèle normalisé de souris de SAH par double injection directe de volumes déterminés de sang entier autologue dans le cisterna magna est présenté. En bref, les souris ont été pesées puis anesthésiées par inhalation d’isoflurane. Ensuite, l’animal a été placé en position inclinable sur une couverture chauffée maintenant une température rectale de 37 °C et placé dans un cadre stéréotaxique avec un virage cervical d’environ 30°. Une fois en place, la pointe d’une micropipette en verre allongé remplie du sang artériel homologue prélevé sur l’artère carotide d’une autre souris du même âge et du même sexe (C57Bl/6J) a été placée à un angle droit en contact avec la membrane atlanto-occipitale au moyen d’un micromanipulateur. Puis 60 μL de sang a été injecté dans la magna de cisterna suivie d’une inclinaison vers le bas de 30° de l’animal pendant 2 minutes. La deuxième perfusion de 30 μL de sang dans le cisterna magna a été effectuée 24 h après la première. Le suivi individuel de chaque animal est effectué quotidiennement (évaluation minutieuse du poids et du bien-être). Cette procédure permet une distribution prévisible et hautement reproductible du sang, probablement accompagnée d’élévation de la pression intracrânienne qui peut être imitée par une injection équivalente d’un liquide céphalo-rachidien artificiel (CSF), et représente un modèle aigu à doux de SAH induisant une faible mortalité.

Introduction

L’hémorragie subarachnoïde (SAH) représente jusqu’à 5% de tous les cas d’AVC et constitue une pathologie relativement commune avec une incidence de 7,2 à 9 patients pour 100.000 par an, avec un taux de mortalité de 20%-60% selon l’étude^1,2,3. Dans la phase aiguë, la mortalité est attribuable à la gravité des saignements, des rebleedings, du vasospasme cérébral (CVS) et/ou des complications médicales⁴. Chez les survivants, les lésions cérébrales précoces (EBI) sont associées à l’extension parenchymale de l’hémorragie et à l’augmentation abrupte de la pression intracrânienne, qui peut entraîner l’ischémie cérébrale primaire⁵ et la mort immédiate dans environ 10%-15% des cas⁶. Après le stade initial « aigu » de la SAH, le pronostic dépend de l’apparition de l’ischémie cérébrale « secondaire » ou retardée (DCI), détectée chez près de 40 % des patients par tomographie calculée cérébrale, et chez jusqu’à 80 % des patients après imagerie par résonance magnétique (IRM)^7,8. En plus du CVS se produisant entre 4 à 21 jours après la rupture d’anévrisme dans une majorité de patients de SAH, DCI⁹ peut résulter des lésions diffuses multifactorielles de cerveau secondaire à la formation de microthrombosis, la perfusion cérébrale réduite, la neuroinflammation, et la dépression corticale de propagation (CSD)^10,11,12,13. Cela affecte 30% des survivants de SAH et affecte les fonctions cognitives, y compris la mémoire visuelle, la mémoire verbale, le temps de réaction, et les fonctions exécutives, visuospatiales et de langage¹⁴ altérant la vie quotidienne¹⁵. Les thérapies standard actuelles pour prévenir cvs et/ou les mauvais résultats cognitifs chez les patients sah sont basées sur le blocage de ca²⁺ signalisation et vasoconstriction en utilisant les inhibiteurs du canal Ca^{2 +} comme Nimodipine. Cependant, des essais cliniques plus récents ciblant la vasoconstriction ont indiqué la dissociation entre les résultats neurologiques du patient et la prévention du CVS¹⁶, suggérant des mécanismes pathophysiologiques plus complexes impliqués dans les conséquences à long terme de SAH. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre le nombre d’événements pathologiques accompagnant la SAH et l’élaboration de modèles animaux valides et normalisés pour tester les interventions thérapeutiques originales.

La rupture d’un anévrisme intracrânien principalement responsable de sah chez l’homme est probablement difficile à imiter dans les modèles animaux précliniques. Actuellement, la rupture de l’anévrisme et la situation sah peuvent provisoirement être testés par la perforation de l’artère cérébrale moyenne (modèle de perforation endovasculaire) responsable des dysfonctionnements CVS et sensitivomoteurs chez les souris^17,18. En raison de l’absence de tout contrôle possible sur l’apparition du saignement et la diffusion du sang dans ce modèle, d’autres méthodes ont été développées chez les rongeurs pour générer des modèles sah sans rupture endovasculaire. Plus précisément, ils consistent en l’administration directe du sang artériel dans l’espace sous-arachnoïd par une seule ou une double injection dans le magna cisterna¹⁹ ou une seule injection dans la citerne préchiasmatique²⁰. Le principal avantage de ces modèles de souris sans rupture endovasculaire est la possibilité de maîtriser reproductiblement la procédure chirurgicale et la qualité et la quantité de l’échantillon de sang injecté. Un autre avantage de ce modèle par perforation endovasculaire en particulier est la préservation du bien-être général de l’animal. En fait, cette chirurgie est moins invasive et techniquement moins difficile que celle nécessaire pour générer une rupture de mur carotide. Dans ce dernier modèle, l’animal doit être intubé et ventilé mécaniquement, tandis qu’un monofilament est inséré dans l’artère carotide externe, et avancé dans l’artère carotide interne. Cela conduit probablement à l’ischémie transitoire due à l’obstruction du navire par la trajectoire de fil. Par conséquent, la comorbidité (état moribond, douleur et mort importantes) associée à la chirurgie est moins importante dans le modèle d’injection double par rapport au modèle de perforation endovasculaire. En plus d’être une SAH plus cohérente, la méthode d’injection double directe est conforme au bien-être des animaux dans la recherche et les tests (réduction du temps sous anesthésie, douleur de perturbation tissulaire dans la chirurgie et la détresse) et conduit à un nombre total minimum d’animaux utilisés pour l’étude du protocole et la formation du personnel.

En outre, cela permet la mise en œuvre du même protocole aux souris transgéniques, conduisant à une compréhension pathologique optimisée de la SAH et la possibilité d’essais comparatifs de composés thérapeutiques potentiels. Ici, nous présentons un modèle normalisé de souris de l’hémorragie sous-arachnoïde (SAH) par une double injection quotidienne consécutive de sang artériel autologue dans le cisterna magna dans 6-8 semaines-vieux mâles C57Bl/6J souris. Le principal avantage de ce modèle est le contrôle du volume de saignement par rapport au modèle de perforation endovasculaire, et le renforcement de l’événement de saignement sans une augmentation drastique de la pression intracrânienne²¹. Récemment, la double injection directe de sang dans la cisterna magna a été bien décrite sur les questions expérimentales et physiopathologiques chez les souris. En effet, nous avons récemment démontré cvs de grandes artères cérébrales (basilar (BA), milieu (MCA) et antérieur (ACA) artères cérébrales), le dépôt de fibrine céphalo-vasculaire et l’apoptose cellulaire du jour 3 (D3) à 10 (D10), les défauts de circulation du liquide céphalospine paravasculaire accompagné de sensitivomoteur altéré et des fonctions cognitives chez les souris, 10 jours post-SAH dans ce modèle²². Ainsi, il rend ce modèle maîtrisé, validé et caractérisé pour les événements à court terme et à long terme post-SAH. Il devrait être idéalement adapté pour l’identification prospective de nouvelles cibles et pour des études sur des stratégies thérapeutiques puissantes et efficaces contre les complications associées à la SAH.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées sous la supervision de H. Castel conformément au comité d’éthique Français et aux lignes directrices de la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Ce projet a été approuvé par la CENOMEXA locale et les comités nationaux d’éthique sur la recherche et l’expérimentation animales. Les souris mâles C57Bl/6J Rj (Janvier), âgées de 8 à 12 semaines, étaient logées dans des condi…

Representative Results

Chronologie expérimentale, procédure, suivi et mortalitéLa figure 1A et la figure 1B résument le protocole du modèle SAH par double injection intracisternale de sang. En bref, le premier jour de l’induction de sah (D-1), 60 μL de sang retiré d’une souris homologue ou 60 μL de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) ont été injectés dans le cisterna magna dans des conditions sah ou de faux, respectivement. Le lendemain (D0…

Discussion

Malgré l’intensité de la recherche dans le domaine de la SAH et le développement de stratégies thérapeutiques telles que les options de traitement endovasculaire et pharmacologique augmentant au cours des vingt dernières années, la mortalité reste élevée au cours de la première semaine d’hospitalisation et atteint environ 50% au cours des 6 mois suivants^24,25. Ce modèle préclinique actuel par double injection quotidienne de sang …

Materials

absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071