Dobbel direkte injeksjon av blod inn i Cisterna Magna som modell av Subaraknoid blødning

Summary

Vi beskrev i denne protokollen en standardisert subaraknoid blødning (SAH) musemodell ved en dobbel injeksjon av autolog fullblod inn i cisterna magna. Den høye graden av standardisering av dobbeltinjeksjonsprosedyren representerer en mellom-til-akutt modell av SAH med relativ sikkerhet angående dødelighet.

Abstract

Blant slag representerer subaraknoid blødning (SAH) som er påfølgende til brudd på en cerebral arteriell aneurisme 5-9%, men er ansvarlig for ca 30% av den totale slagrelaterte dødeligheten med en viktig sykelighet når det gjelder nevrologisk utfall. En forsinket cerebral vasospasme (CVS) kan forekomme oftest i forbindelse med en forsinket cerebral iskemi. Ulike dyremodeller av SAH blir nå brukt, inkludert endovaskulær perforering og direkte injeksjon av blod i cisterna magna eller til og med den prechiasmatic sisternen, hver viser forskjellige fordeler og ulemper. I denne artikkelen presenteres en standardisert musemodell av SAH ved dobbel direkte injeksjon av bestemte volumer av autologt fullblod inn i cisternamagnaten. Kort tid ble mus veid og deretter bedøvet ved isofluraninnånding. Deretter ble dyret plassert i en liggende stilling på et oppvarmet teppe som opprettholder en rektal temperatur på 37 ° C og plassert i en stereotaktisk ramme med en cervical bend på ca 30 °. Når den er på plass, ble spissen av en langstrakt glassmikropipett fylt med homolog arterielt blod tatt fra halspulsåren til en annen mus på samme alder og kjønn (C57Bl/6J) plassert i rett vinkel i kontakt med atlanto-occipital membran ved hjelp av en mikropulator. Deretter ble 60 μL blod injisert i cisterna magna etterfulgt av en 30 ° nedadgående tilt av dyret i 2 minutter. Den andre infusjonen av 30 μL blod inn i cisterna magna ble utført 24 timer etter den første. Den individuelle oppfølgingen av hvert dyr utføres daglig (nøye evaluering av vekt og velvære). Denne prosedyren tillater en forutsigbar og svært reproduserbar fordeling av blod, sannsynligvis ledsaget av intrakranielt trykkøkning som kan etterlignes ved en tilsvarende injeksjon av en kunstig cerebral spinalvæske (CSF), og representerer en akutt til mild modell av SAH som induserer lav dødelighet.

Introduction

Subaraknoid blødning (SAH) står for opptil 5% av alle slagtilfeller og utgjør en relativt vanlig patologi med en forekomst på 7,2 til 9 pasienter per 100.000 per år, med en dødelighet på 20% -60% avhengig av^{studien 1,2,3}. I den akutte fasen skyldes dødeligheten alvorlighetsgraden av blødning, rebleeding, cerebral vasospasme (CVS) og/ eller medisinske komplikasjoner⁴. Hos overlevende er tidlig hjerneskade (EBI) forbundet med parenchymal forlengelse av blødning og brå økning i intrakranielt trykk, noe som kan resultere i primær cerebral iskemi⁵ og umiddelbar død i ca 10% -15% av^{tilfellene 6}. Etter den første “akutte” fasen av SAH, avhenger prognosen av forekomsten av “sekundær” eller forsinket cerebral iskemi (DCI), påvist hos nesten 40% av pasientene ved cerebral computertomografi, og hos opptil 80% av pasientene etter magnetisk resonansavbildning (MR)^7,8. I tillegg til CVS som oppstår mellom 4 og 21 dager etter aneurismebrudd hos et flertall av SAH-pasienter, kan DCI⁹ skyldes multifaktorielle diffuse hjerneskader sekundært til mikrotrombosedannelse, redusert cerebral perfusjon, nevroinflammasjon og kortikale spredningsdepresjon (CSD)^10,11,12,13. Dette påvirker 30% av SAH overlevende og påvirker kognitive funksjoner, inkludert synsminne, verbal hukommelse, reaksjonstid, og utøvende, visuospatial og^{språkfunksjoner 14} svekke dagliglivet¹⁵. Gjeldende standardbehandling for å forhindre CVS og/eller de dårlige kognitive resultatene hos SAH-pasienter er basert på blokkering av Ca²⁺ signalisering og vasokonstriksjon ved å bruke Ca²⁺ kanalhemmere som nimodipin. Nyere kliniske studier rettet mot vasokonstriksjon viste imidlertid dissosiasjon mellom pasientens nevrologiske utfall og forebygging av CVS¹⁶, noe som tyder på mer komplekse patofysilogiske mekanismer involvert i SAH-langsiktige konsekvenser. Derfor er det et medisinsk behov for større forståelse av antall patologiske hendelser som følger med SAH og utviklingen av gyldige og standardiserte dyremodeller for å teste originale terapeutiske inngrep.

Bruddet på en intrakraniell aneurisme som for det meste er ansvarlig for SAH hos mennesker, er sannsynligvis vanskelig å etterligne i prekliniske dyremodeller. For tiden kan aneurismebruddet og SAH-situasjonen foreløpig testes ved perforering av den midterste hjernearterien (endovaskulær punkteringsmodell) som er ansvarlig for CVS og sensitivomotoriske dysfunksjoner hos mus^17,18. På grunn av mangel på mulig kontroll over blødningsoppståret og spredning av blod i denne modellen, har andre metoder blitt utviklet hos gnagere for å generere SAH-modeller uten endovaskulær brudd. Mer presist består de av direkte administrering av arterielt blod inn i subaraknoidrommet gjennom en enkelt eller en dobbel injeksjon i magnakisterna¹⁹ eller en enkelt injeksjon i den prechiasmatiske sisternen²⁰. Den største fordelen med disse musemodellene uten endovaskulær brudd er muligheten til å reprodusere kirurgisk prosedyre og kvaliteten og mengden av den injiserte blodprøven. En annen fordel med denne modellen over modellen ved endovaskulær perforering er spesielt bevaring av dyrets generelle velvære. Faktisk er denne operasjonen mindre invasiv og teknisk mindre utfordrende enn det som kreves for å generere et halsbånd. I denne siste modellen må dyret intuberes og mekanisk ventileres, mens et monofilament settes inn i den ytre halspulsåren, og avanserte inn i den indre halspulsåren. Dette fører sannsynligvis til forbigående iskemi på grunn av fartøyobstruksjon av ledningsbanen. Følgelig er komorbiditeten (moribund tilstand, viktig smerte og død) forbundet med kirurgi mindre viktig i dobbel injeksjonsmodell sammenlignet med endovaskulær perforeringsmodell. I tillegg til å være en mer konsekvent SAH, den doble direkte injeksjon metoden er i samsvar med dyrevelferd i forskning og testing (redusert tid under anestesi, smerte fra vev avbrudd i kirurgi og nød) og fører til et minimum totalt antall dyr som brukes til protokollen studien og personell trening.

Videre tillater dette implementering av samme protokoll til transgene mus, noe som fører til en optimalisert patologisk forståelse av SAH og muligheten for komparativ testing av potensielle terapeutiske forbindelser. Her presenterer vi en standardisert musemodell av subaraknoid blødning (SAH) ved en dobbel daglig påfølgende injeksjon av autolog arterielt blod inn i cisterna magna i 6-8 uker gamle mannlige C57Bl/6J mus. Den største fordelen med denne modellen er kontrollen av blødningsvolumet sammenlignet med den endovaskulære perforeringsmodellen, og forsterkning av blødningshendelsen uten en drastisk økning av intrakranielt trykk²¹. Nylig har den doble direkte injeksjonen av blod inn i cisternamagnaten blitt godt beskrevet på de eksperimentelle og fysipatologiske problemene hos mus. Faktisk har vi nylig demonstrert CVS av store cerebrale arterier (basilær (BA), midten (MCA) og fremre (ACA) cerebrale arterier), cerebrovaskulær fibrin deponering og celle apoptose fra dag 3 (D3) til 10 (D10), sirkulasjonsfeil av paravaskulær cerebrospinalvæske ledsaget av endrede sensitivomotoriske og kognitive funksjoner hos mus, 10 dager etter SAH i denne modellen²². Dermed gjør det denne modellen mestret, validert og karakterisert for kortsiktige og langvarige hendelser etter SAH. Det bør være ideelt egnet for prospektiv identifisering av nye mål og for studier på potente og effektive terapeutiske strategier mot SAH-assosierte komplikasjoner.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført under tilsyn av H. Castel i samsvar med den franske etiske komité og retningslinjer i Europaparlamentsdirektivet 2010/63/EU og Rådet for beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Dette prosjektet ble godkjent av den lokale CENOMEXA og de nasjonale etikkkomiteene for dyreforskning og testing. Hann C57Bl/6J Rj mus (Janvier), i alderen 8–12 uker, ble plassert under kontrollerte standard miljøforhold: 22 °C ± 1 °C, 12 timer/12 timer lys/mørk syklus, og vann og mat tilgjeng…

Representative Results

Eksperimentell tidslinje, prosedyre, oppfølging og dødelighetFigur 1A og figur 1B oppsummerer SAH-modellprotokollen ved dobbel intrakransisk injeksjon av blod. Kort sagt, på den første dagen av SAH induksjon (D-1), 60 μL blod trukket tilbake fra en homolog mus eller 60 μL kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) ble injisert i cisterna magna i SAH eller sham forhold, henholdsvis. Neste dag (D0) ble 30 μL blod trukket tilbake fra en homolog …

Discussion

Til tross for intensiteten av forskningen innen SAH og utviklingen av terapeutiske strategier som endovaskulære og farmakologiske behandlingstilbud øker i løpet av de siste tjue årene, er dødeligheten fortsatt høy i løpet av den første uken av sykehusinnleggelse og når ca 50% i løpet av de følgende 6^{månedene 24,25}. Denne nåværende prekliniske modellen ved daglig dobbel injeksjon av homologt arterielt blod inn i cisterna magna har b…

Materials

absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071