用异体皮肤移植重建的烧伤伤口的穆林模型

Summary

本研究的目的是开发烧伤伤口愈合的穆林模型。使用预热的黄铜模板在小鼠的后皮上引起热灼伤。燃烧的组织被除去，并覆盖与皮肤移植从基因相似的捐赠小鼠的尾巴收获。

Abstract

琐碎的肤浅伤口愈合没有并发症的主要意图。深层伤口，如全厚烧伤，通过二次意图愈合，需要手术脱毛和皮肤移植。将供体移植物成功整合到受助人伤口床取决于及时招募免疫细胞、强健的血管反应和新的细胞外基质形成。新型治疗剂的发展，针对伤口愈合的一些关键过程，由于缺乏可靠的临床前模型和伤口闭合的优化客观评估而受阻。在这里，我们描述了一个廉价和可重复的模型，实验全厚度烧伤伤口重建与异体皮肤移植。伤口在BALB/C和SKH1-Hrhr背景麻醉的近亲繁殖野生型小鼠的多苏姆表面诱发。烧伤使用直径为10毫米的黄铜模板生产，该模板预热至80°C，以恒定压力提供20 s。 烧伤埃沙尔在受伤后24小时被切除，并更换为从基因相似的供体小鼠尾部收获的全厚度移植物。手术不需要专门的设备，手术技术也很容易遵循。在大多数研究环境中，该方法可以毫不费力地实现和复制。某些限制与模型相关。由于技术困难，无法收获较薄的分裂厚度皮肤移植。我们在这里描述的手术方法允许使用全厚度的皮肤移植重建烧伤伤口。它可用于进行临床前治疗测试。

Introduction

手术脱毛和皮肤移植是用于管理慢性伤口^1，烧伤伤口^2，和急性伤口，如创伤伤口3的常见临床^做法。皮肤移植是指外科手术，它涉及从身体的一个部位去除健康的皮肤，并转移到另一部分。捐赠者移植物取代了丢失的组织，为细胞迁移和生长提供了一个结构脚手架。在整合到接收方现场后，皮肤移植物通过提供微生物入侵、外部环境有害影响和水分过度流失等防护，取代了失去^{的皮肤屏障}。成功的皮肤移植整合取决于几个因素。其中包括在微生物感染和及时解决炎症时作出充分的免疫反应，在伤口场建立健壮的血管生成，以及在接受者床和供体移植物^之间建立血管性血管性血管。当移植物开始降解时，居民皮肤细胞必须被能够产生新的细胞外基质的细胞所取代。同时，表皮角蛋白细胞必须爬过新产生的基质，形成新表皮，重新上皮化伤口。因此，很明显，细胞从接受者床有效迁移到供体移植物是影响成功移植物结合的另一个决定性因素。鉴于伤口愈合涉及的大量因素^，由于伦理限制，在人体试验中可能无法控制，因此有必要进行临床前实验皮肤移植模型。开发烧伤伤口愈合和相关皮肤移植的临床前模型对于了解皮肤组织修复所涉及的复杂机制非常重要，并且对于测试新的治疗剂至关重要。伤口愈合的体外模型无法准确模拟皮肤组织的复杂性。体内动物模型是了解组织修复机制不可或缺的调查工具。

在啮齿动物身上开发了几种皮肤移植技术，以模拟手术切除和烧伤伤口重建^{7，8，9。,8,9}然而，大多数前面描述的程序未能在皮肤移植之前诱发热烧伤。而不是烧伤伤口，诱导一个完整的厚度切除伤口，然后重建与全厚度的皮肤同体^7。各种解剖地标，如耳朵，尾巴和背部已被用来收获啮齿动物^{7，8的捐赠皮肤}。报告了不同的移植固定和稳定技术，包括”无缝合技术^“9，缝合^7和手术胶10，11，12。^10,11,12

本研究的目的是开发一个全厚度烧伤伤口的穆林模型，将回顾目前烧伤治疗的黄金标准方法，其中包括不活的组织切除和皮肤移植。使用预热的黄铜模板在鼠标的多苏姆表面引起热灼伤。烧伤埃沙尔被切除，并替换为从捐赠小鼠尾部收获的全厚移植物。这种实验模型有三个主要优点。首先，在受助小鼠的背上可能诱发多个烧伤伤口，从受助小鼠的单尾中可收获四个供体皮肤移植物。这意味着，可能使用相同的接受者和捐赠动物来比较几种实验和控制疗法。根据所需的给药途径，控制治疗可能包括对车辆或安慰剂控制的局部或全身给药（例如，软膏的局部应用、皮下、内皮或静脉注射溶液）。其次，可以控制治疗的时间和实验的终点。第三，这个模型取决于伤口的重建使用从尾巴收获的全厚度移植，这是已知的有更高的概率，成功地纳入捐赠地点相比，从背部^{13收获的皮肤}。这可能是由于表皮兰格汉斯细胞的数量减少，在皮肤免疫生物学中起着关键作用，并且与皮肤移植排斥^14有关。

建议的伤口愈合和移植整合模型很可能应用于转基因和敲除小鼠。使用转基因小鼠将有助于阐明某些基因在伤口修复过程中可能扮演的角色。也可以考虑在损伤现场进行局部伤口制剂或治疗抗体的皮下注射。

由于技术困难，由表皮和部分真皮组成的分厚皮肤移植在小鼠中很难获得。众所周知，由表皮和全厚真皮组成的全厚度皮肤移植物需要一个血管良好的伤口床才能成功整合。无法在小鼠身上收获分裂厚度皮肤移植物可能被视为此模型的一个限制。皮肤移植到接受者伤口床的固定是通过应用手术胶粘胶实现的，与其他组织固定方法相比，这种粘胶与更少的创伤和快速降解^有关。先前的研究表明，在手术后¹⁵小时，与手术胶相比，粘附与更强的组织固定有关，这可能被认为是手术的缺点。然而，在后来的点，用手术胶粘剂治疗的伤口的生物力学强度变得可与缝合¹⁵和优于主食固定^16。使用手术胶水固定组织后，伤口必须用伤口敷料覆盖。虽然小鼠的后面伤口很难被动物接触，但另一方面，伤口敷料很容易被动物操纵和切除。可能需要频繁更换伤口敷料。

麻醉引起的小啮齿动物体温过低是一个有据可查的现象^17。体温过低是此过程的副作用，它会导致并发症，并可能损害动物健康和数据质量。因此，此方法保证实施温度管理策略，尤其是在使用无毛 SKH1-Hrhr 时。

使用小鼠模仿人体伤口闭合的最显著限制是皮肤解剖学和生理学的区别。老鼠的伤口主要通过收缩愈合，而人类伤口通过造粒组织形成和再上皮^18愈合。为了解释这种差异，目前的模型可以修改，并结合夹板环紧紧粘在伤口周围，以防止皮肤^收缩19。鉴于这种体内协议的一些优点和缺点，这个模型可以作为一个工具来研究伤口愈合中的某些过程，这些过程不可能在体外研究。

Protocol

所有实验都得到法国高等教育和研究部的批准（研究编号：12216201711616517670v2 和DAP180012）。所有小鼠在抵达时都存放在塑料笼子里，在研究前可以进行7天的适应期。动物室保持12/12小时光/暗循环（07：00灯亮）。食物和自来水被提供。BALB/c和SKH1-Hrr小鼠被喂养传统的小麦/大豆为基础的饮食。提供锯末床上用品和筑巢材料。 1. 设备准备 为该过程准备一个燃烧装置，并使用温度控制器将燃烧装置设置为 80°C（图 1A）。使用红外热像仪验证黄铜模板的温度 （图 1B，C）。 确保数字气压计工作正常。 用手术窗帘盖住舞台并调整桌子的高度（图1A）。 2. 术前和术内动物护理 获得BALB/c和SKH1-Hrr小鼠，6-8周大。 将扑热息痛悬浮液以3毫克/mL添加到饮用水中，并在手术前12小时和手术后72小时内供应。 使用 1 mL 注射器和 26 G 针头，在手术前 30 分钟以 0.05 μg/g 的皮下施用丁丙诺啡，在手术后前 72 小时每 6 小时施用一次。 使用 1 mL 注射器和 26 G 针头，将利多卡因注射到小鼠的剂量和烧伤伤口区域的 2-3 mm在烧伤伤口感应前 15 分钟，在 0.05 μg/g 下皮注射利多卡因。 麻醉小鼠使用内丙酮注射的木胺在10毫克/千克和氯胺酮100毫克/公斤。使用 1 mL 注射器和 26 G 针头进行注射。 关键步骤：将麻醉小鼠放在加热垫上，使鼠标保持温暖，以防止麻醉诱导后前30分钟和麻醉恢复后至少15分钟体温过低。除加热垫外，其他方式，包括热灯、循环热液或空气，以及预热热储层，都可用于调节体温。 在小鼠眼睛上涂抹润滑凝胶，以防止角膜脱水。 使用手趾捏戒反射评估麻醉深度。 使用 1 mL 注射器和 26 G 针头管理 200 μL 的乳环环溶液，并辅以 5% 的葡萄糖。麻醉诱导后立即进行液体置换，并在手术后6小时立即更换液体，以防止脱水。 3. 全厚度烧伤伤口感应 用剪发器剃麻醉鼠标。 在鼠标的多苏姆表面涂抹脱毛霜1分钟。用无菌纱布擦去奶油，然后用一块湿纱布清洁区域。用纱布擦去皮肤，直到干燥。 将鼠标放在覆盖着手术窗帘的舞台上，将舞台向上移动，靠近预热的黄铜模板。 使用 0.15 N 的恒定压力在鼠标背面应用圆形黄铜模板（80 °C，20s）。 关键步骤：烧伤诱导后，立即将麻醉动物放在加热垫上，以防止体温过低，并在手术期间和之后保持小鼠温暖。麻醉后，将鼠标放回笼子。 关键步骤：在手术后的72小时内在笼子地板上提供捣碎的饮食。在烧伤受伤后，老鼠有时不愿意伸手到吸管前喝水。 4. 收获捐赠嫁接 在捐赠小鼠尾部的上部用手术刀进行纵向切口，并使用手术钳轻轻切除皮肤。 将尾皮放入无菌培养皿中，里面装满了 10 mL 的无菌 0.9% 盐水溶液。使用尺子测量出单个移植物，并使用手术刀将尾皮切成碎片，每个碎片尺寸为 15 mm。 一旦准备好，保持皮肤移植在0.9%盐水溶液在4°C长达2小时。 5. 手术切除和皮肤移植 烧伤诱导后24小时，通过吸入异氟兰为麻醉准备小鼠。将鼠标放入感应室，在 100% 氧气中使用 5% 异氟兰诱导麻醉，流速为 4 L/min。为了在手术期间保持麻醉，在2升/分钟时使用2%异氟。 在鼠标上放置手术窗帘，切开窗户露出手术场。使用无菌技术，先用波维酮碘拭拭伤口，然后用70%的酒精拭拭伤口。 用一对手术钳轻轻拾取烧伤的组织，用无菌手术剪刀和钳子切除所有坏死和不可行的组织。取出皮下层的潘尼库鲁斯肉管层，创建一个稳定的接受者床。 将皮肤移植物放在新准备的伤口床上。使用手术钳子轻轻地将周围皮肤拉向皮肤移植。涂抹一些手术粘合剂，将移植物连接到伤口床上，轻轻按压以对齐皮肤边缘。关键步骤：伤口床的大小必须略大于皮肤移植的大小，以确保成功移植。 让鼠标从麻醉中恢复过来。关键步骤：将鼠标放在加热垫上。在手术期间和之后保持鼠标温暖，以防止体温过低。 在移植的伤口上涂抹惰性石蜡纱布敷料和粘合剂二次敷料。 将鼠标放入单个保持架中。关键步骤：在手术后的72小时内在笼子地板上提供一些捣碎的饮食，并每天进行监测。 提供玩具，丰富环境。 6. 数字成像和验尸伤口收集 在伤口旁边放置一把尺子，用数码相机拍摄伤口（图3）。 在实验的终点，通过接触二氧化碳和宫颈脱位来安乐死动物。关键步骤：在宫颈脱位期间皮肤的过度拉扯作用可能会损坏移植物。 在验尸时，用剪刀手术将后伤切除到筋膜上。二分伤口。修复一半在10%缓冲的甲醛和过程组织学和免疫组织化学。快速冻结液氮中的另一半，用于RNA提取和蛋白质定量，并保持在-80°C。 7. 皮肤组织学、免疫组织化学和胶原蛋白可视化 将皮肤样本嵌入石蜡中，切成4μm部分，并放入带正电的幻灯片上。 使用沾有赤氧素和 eosin 的幻灯片来评估重新上皮率（原伤口的百分比）。用新表皮覆盖的伤口区域可以表示为整个伤口的百分比（图4）。使用数字显微镜应用和 ImageJ 软件对各部分进行微观分析。 使用从形式固定和石蜡嵌入组织制备的组织学部分（4 μm 厚度），并受免疫组织化学治疗。 要评估伤口中的胶原蛋白 I 和纤维素表达，应用初级抗体并孵育 1 小时。 反应部分：（i） HRP，3，3′-二甲苯胺 （DAB） 或 （ii） AP，粘结聚合物精炼红色（材料表），产生明亮的红色（图5）。使用仪器扫描各部分，并使用数字显微镜应用和 ImageJ 进行分析。 为了对胶原蛋白沉积进行组织学评估，使用商业试剂盒在组织学部分进行三色染色。 对于胶原纤维可视化，请使用多光子显微镜和第二次谐波生成技术（图5）。使用多光子显微镜进行组织成像，如前面所述的20。使用中心波长为 810 nm 的 Ti：Sapphire 激光器作为产生二次谐波和双光子激动荧光信号 （TPEF） 的激光源。 使用配备 25x/0.95 W 目标的激光束收集和激发二次谐波生成 （SHG） 和 TPEF。检测信号，如前21 所述，由 NDD PMT 探测器。使用软件进行激光扫描控制和图像采集。

Representative Results

结果表明，该协议开发是一种简单明了的方法，允许在小鼠中诱导全厚度烧伤伤口。烧伤是使用预热黄铜模板诱导的（图1A-C）。烧伤区域显示为圆形伤口，带白色 eschar 和高血区。烧伤伤口的大小在烧伤后24小时内稍大一些，因为众所周知的现象被称为烧伤进展，这可能是由于急性炎症22。切除后，烧伤伤口使用异体皮肤移植重建（图3）。烧伤后的第7天，伤口变得血管化5，这是成功移植的迹象。表皮角膜细胞从相邻的接受者皮肤迁移，以努力关闭伤口并弥合伤口两边缘之间的间隙。对伤口H和E染色部分的微观分析表明，与烧伤后第3天相比，烧伤后第7天新皮皮的长度明显延长（图4B）。在进行大型研究之前，强烈建议研究人员完成一项试验性研究，从而能够探索一种新的干预、评估可行性、确定修改方法以确保可重复性。在较小的样本中很难检测到具有统计显著性的影响，而增加样本大小是提高测试的统计能力的方法之一。例如，要检测组间伤口再上皮化率（p < 0.05）的统计显著差异（图4），样本大小应介于每组6至8只小鼠之间。所有实验至少应重复两次。当产生细胞的基质（如成纤维细胞）从接受组织迁移到移植体时，细胞外基质的关键成分，包括胶原蛋白 I 和纤维素在新形成的基质中变得高度表达（图 5）。 图 1：刻录设备设置。（A） 刻录装置的放置和设置。燃烧装置连接到温度控制器，并连接到数字单度计，以便监控压力。燃烧装置悬浮在可调级以上 – 平坦的表面，将鼠标放置在其上以感应燃烧。（B-C）用于诱发伤口烧伤的黄铜模板的特写图像。（C） 黄铜模板的直径为1厘米。请点击这里查看这个数字的较大版本。 图 2：本文中描述的复制实验模型所需的不同步骤的示意图。手术有三个主要步骤：（一） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（二） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（三） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（三） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（三） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（六） 使用预热黄铜模板感应烧伤伤口;（六） 使用预热（二） 烧伤后24小时对不可行的坏死组织进行手术切除;（三） 手术伤口重建使用从捐赠小鼠收获的全厚异体皮肤移植物。请单击此处查看此图的较大版本。 图3：重建小鼠烧伤伤口的宏观视角。烧伤伤口的代表性数字图像重建与异体皮肤移植在烧伤后的第0天，第1天，第3天和7天。图像上的标尺以毫米为单位。请单击此处查看此图的较大版本。 图4：烧伤后3天和7天伤口的微观外观。烧伤后 3 天和 7 天伤口的 H&E 染色部分。与（B）第7天伤口相比，第3天伤口的新表皮（虚线）长度显著增加。在 （A） 和 （B） 中，刻度杆为 100 μm. （C） 伤口再上皮化百分比的图形表示。通过测量第3天和7天烧伤后新皮毛的长度进行评估，并以整个伤口长度的百分比表示。结果表示均值 = S.E.M.（n = 第 3 组中的 6 只小鼠;第 7 组为 6 只小鼠，*p < 0.05;学生 t – 测试）。请单击此处查看此图的较大版本。 图5：细胞外基质和胶原蛋白 I 可视化的评估。免疫组织化学分析的代表图像，第7天老鼠伤口染色为（A） 胶原蛋白和（B） 纤维素.注意在拉长主轴形胶原蛋白 I 阳性细胞中强烈的红色染色。注意第7天伤口真皮中纤维素阳性细胞的棕色染色。在所有图像中缩放栏 = 50 μm。在 （A） 和 （B） 中 ， e 表示表皮， d 表示真皮.（C） 胶原纤维的可视化和胶原蛋白沉积的组织学评估。（D） 代表TPEF/SHG胶原蛋白图像第7天老鼠伤口。使用圆极化和SHG信号同时采集TPEF/SHG，在应用阈值后，选择性地处理，以获得SHG的二进制分布。TPEF 图像（绿色）和 SHG 图像（白色）为伪彩色并叠加。比例线 = 50 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

根据烧伤^23的厚度分类，全厚度烧伤的特点是皮肤整体厚度和皮下组织某些部分明显介入。这种类型的伤口只能通过收缩或皮肤移植^2愈合。本文中描述的方法的固有限制是，只有全厚度嫁接，而不是分裂厚度嫁接，这是常在临床环境中使用，收获从小鼠的尾巴。这是由于技术难度，因为鼠标皮肤太薄，获得分裂厚度嫁接。必须指出，全厚度移植需要一个良好的血管化伤口床，而分裂厚度的皮肤移植能够生存在捐赠点与较少的血管^24。先前的研究表明，在小鼠背部诱发的烧伤伤口与新血管5的强健形成^有关。这表明，一个良好的血管化区域，如小鼠的伤口，可以被认为是诱导烧伤伤口的解剖里程碑。

烧伤伤口深度是需要考虑的重要因素。烧伤伤口的深度必须在单个小鼠之间保持一致。烧伤伤口深度的可重复性取决于黄铜模板的温度、压力和热暴露持续时间。必须组织验证烧伤伤口深度。重要的是要记住，过度的压力或皮肤长时间暴露在预热的黄铜模板可能会伤害底层组织。椎柱周围的组织，包括中枢和周围神经系统的成分，对热敏感，如果损坏可能导致后腿瘫痪。

虽然没有术后死亡率与外科手术直接相关，但少数无毛SKH1-Hrhr小鼠对感冒特别敏感，出现体温过低，全身麻醉后无法恢复。因此，在所有美容活动中必须提供补充热量，在麻醉小鼠时需要持续监控。

本研究中描述的方法与手术场感染不相关。然而，无菌技术必须用于防止微生物在手术周期内转移到手术伤口。用生物发光或荧光微生物接种伤口可以纳入手术程序。这项技术可能有助于研究传染性生物及其发病机制^25。例如，外源性添加或注射生物发光细菌，可以允许监测微生物负担使用体内整个动物成像^25。鉴于已知小鼠毛发会干扰体内整个动物荧光和生物发光成像，无毛SKH1-Hrhr小鼠是有关荧光或生物发光记者研究的理想宿主。

伤口组织样本可在不同的时间点采集，并处理进行组织学和免疫组织化学分析。蛋白质和RNA可能从皮肤活检中分离，分子生物学技术可用于评估参与伤口愈合的关键分子的表达。

本研究，我们描述了烧伤伤口愈合和异体皮肤的实验性模型。此过程可以修改，并用作临床前研究的模型。

Materials

1 ml syringue	Terumo	SS + 01T1
26 G needle	Terumo Agani	NN-2613R	1/2'' – 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish	Dutscher	193199
Animal Weighing scale	Kern	EMB 5.2K5
BALB/c mouse	Janvier labs	BALB/cAnNRj	6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm	Simport	M476-1
Bond polymer Refine Red	Leica Biosystems	DS9390
Brass block	BVG	custom-designed	Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE)	Axience	FR/V/6328396 3/2011	administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400	TraçaMatrix	34010
CaseViewer	3DHISTECH Ltd.		3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody	Abcam	ab34710	Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose)	Sigma Aldrich	G-8769-100 ml
DAB	Leica Biosystems	AR9432
Digital camera	NIKON	D3400	objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream	Veet
Disposable scalpels	Swann Morton	6601
DPBS	PAN biotech	P04-36300
Ethanol absolute	VWR chemicals	20821.310
Fibronectin antibody	Abcam	ab23750	Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um	Sartorius	16532
Fine Scissors	F.S.T.	14094-11
Forceps Dumont	F.S.T.	11295-10
Hair clippers	AESCULAP	B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad	Petelevage	120070
Isofluorane	Piramal healthcare	FR/V/03248850/2011
Ketamine	Imalgene	FR/V/0167433 4/1992	surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution	Flee-Flex	1506443
Lamina multilabel slide scanner	Perkin Elmer
LAS software	Leica		version 2.7.3
Leica Bond III	Leica Biosystem	1757
Leukosilk dressing	BSN medical	72669-01
Lidocaine	Aguettant	N01BB02	local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer	Kern	HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit	Sigma-Aldrich	HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes	Simport	M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope	Leica microsystems	DM500	Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic	Systagenix	A6222	12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel	Tvm France	###
Paracetamol 300mg	Dolliprane	Liquiz
Paraformaldheyde 4%	VWR chemicals	1169945
Povidone-iodine	MEDA pharma	D08AG02	diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse	Charles river	686SKH1-HR	6-weeks old
Slides	Thermoscientific	AGAA000080
Surgical adhesive	BSN medical	9927
Sterile Gauze	Hartmann	418545/9	10 X 10 cm
Sterile water	Versylene Fresenius	B230521
Surgical drape	Hartmann	2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra	Coherent	DS 16-02-16 F	690-1040 nm
Thermal imaging Camera	Testo	Testo 868
Xylazine (Rompum 2%)	Bayer	FR/V/ 8146715 2/1980	surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg