Summary
وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير نموذج مورين من حرق التئام الجروح. تم احراق حراري على الجلد الظهري للفئران باستخدام قالب نحاسي محمّد مسبقاً. تم احتراق الأنسجة المحترقة ومضافًا مع ترقيع جلدي تم حصاده من ذيل فأر متبرع مشابه وراثيًا.
Abstract
تُشفى الجروح السطحية التافهة دون مضاعفات بنية أساسية. الجروح العميقة، مثل الحروق سمك كامل، تلتئم من قبل نية الثانوية وتتطلب شظايا الجراحية وتطعيم الجلد. يعتمد الاندماج الناجح للكسب غير المشروع للمتبرع في سرير جرح المتلقي على توظيف الخلايا المناعية في الوقت المناسب، والاستجابة القوية للأوعية وتشكيل المصفوفة خارج الخلية الجديد. إن تطوير عوامل علاجية جديدة، والتي تستهدف بعض العمليات الرئيسية التي تنطوي عليها عملية التئام الجروح، يعوقه عدم وجود نماذج سابقة للكلينيكية يمكن الاعتماد عليها مع التقييم الموضوعي الأمثل لإغلاق الجروح. هنا، ونحن وصف نموذج غير مكلفة وقابلة للاستنساخ من حرق كامل سمك تجريبي الجرح أعيد بناؤها مع الكسب غير المشروع الجلد. يتم حث الجرح على سطح الظهر من الفئران البرية المهدّغة من خلفيات BALB/C و SKH1-Hrhr. يتم إنتاج الحرق باستخدام قالب نحاسي يبلغ قطره 10 مم ، وهو محمّى مسبقًا إلى 80 درجة مئوية ويتم تسليمه بضغط مستمر لمدة 20 s. يتم استئصال Burn eschar بعد 24 ساعة من الإصابة واستبداله بكسب غير مشروع كامل سمك يتم حصاده من ذيل فأر متبرع مماثل وراثيًا. لا توجد حاجة إلى معدات متخصصة لإجراء العملية، والتقنيات الجراحية هي واضحة لمتابعة. قد يتم تنفيذ الأسلوب دون عناء وإعادة إنتاجها في معظم إعدادات البحث. ترتبط بعض القيود مع النموذج. بسبب الصعوبات التقنية ، فإن حصاد ترقيع الجلد سمك الانقسام أرق غير ممكن. الطريقة الجراحية التي وصفناها هنا تسمح بإعادة بناء الجروح المحترقة باستخدام الطعوم الجلدية الكاملة السماكة. ويمكن استخدامه لإجراء الاختبارات العلاجية قبل الفحص.
Introduction
اضاءة الجروح الجراحية وتطعيم الجلد هي ممارسات سريرية شائعة تستخدم في إدارة الجروح المزمنة1, الجروح الحروق2, والجروح الحادة مثل الجروح الرضية3. يشير تطعيم الجلد إلى الإجراء الجراحي ، الذي ينطوي على إزالة بشرة صحية من جزء واحد من الجسم ونقله إلى آخر. الطعوم المانحة تحل محل الأنسجة المفقودة وتوفر سقالة هيكلية للهجرة الخلوية والنمو. بعد الاندماج في موقع المتلقي، والطعوم الجلد محل حاجز الجلد المفقودة من خلال توفير الحماية من الغزو الميكروبي، والآثار الضارة للبيئة الخارجية وفقدان المفرط للرطوبة4. نجاح الجلد الكسب غير المشروع التكامل يعتمد على عدة عوامل. وتشمل هذه الاستجابات المناعية الكافية في وجود التهابات الميكروبية وحل في الوقت المناسب من التهاب, الأوعية الدموية القوية في موقع الجرح وإنشاء الأنستوموزات الوعائية بين السرير المتلقي والكسب غير المشروع المانح5. كما يبدأ الكسب غير المشروع في التحلل، يجب استبدال الخلايا الجلدية المقيمة بالخلايا القادرة على إنتاج مصفوفة جديدة خارج الخلية. في الوقت نفسه، يجب أن تزحف خلايا الكيراتينينية البشرة فوق المصفوفة التي تم إنتاجها حديثًا لتشكيل البشرة الجديدة وإعادة الظهارة للجرح. ولذلك، من الواضح أن هجرة الخلايا بكفاءة من السرير المتلقي إلى الكسب غير المشروع للمانحين هو عامل حاسم آخر يؤثر على نجاح عملية دمج الكسب غير المشروع. نظرا للعدد الهائل من العوامل التي تنطوي على التئام الجروح6، والتي قد يكون من المستحيل السيطرة عليها في التجارب على الإنسان بسبب القيود الأخلاقية ، ونماذج من قبل السريرية التجريبية الجلد تطعيم ضرورية. تطوير نماذج ما قبل السريرية من التئام الجروح حرق والتطعيم الجلد المرتبطة بها تكون مهمة لفهم الآليات المعقدة المشاركة في إصلاح الأنسجة الجلدية وضرورية لاختبار العوامل العلاجية الجديدة. النماذج في المختبر من التئام الجروح غير قادرة على محاكاة بدقة تعقيد الأنسجة الجلدية. نماذج الحيوانات في الجسم الحي هي أداة لا غنى عنها التحقيق في فهم الآليات التي تشارك في إصلاح الأنسجة.
تم تطوير عدة طرق لتقنية تطعيم الجلد في القوارض لتقليد الختان الجراحي وحرق إعادة بناء الجروح7،8،9. ومع ذلك، فشلت معظم الإجراءات الموصوفة سابقاً في إحداث إصابة حرق حراري قبل تطعيم الجلد. بدلا من الجرح الحروق، تم حث جرح ختان كامل سمك، الذي أعيد بناؤه بعد ذلك مع الجلد كامل سمك allograft7. وقد استخدمت معالم تشريحية مختلفة مثل الأذن واللذيل والظهر لحصاد الجلد المانح في القوارض7،8. تم الإبلاغ عن تقنيات مختلفة لتثبيت الكسب غير المشروع والاستقرار ، بما في ذلك "تقنية عدم خياطة"9، خياطة7 والغراء الجراحي10،11،12.
وكان الغرض من هذه الدراسة لتطوير نموذج مورين من جرح حرق سمك كامل من شأنه أن يُجسّد النهج القياسي الحالي للذهب في علاج الحروق، والذي ينطوي على ختان الأنسجة غير القابلة للحياة وتطعيم الجلد. تم حث حرق حراري على سطح الظهر من الماوس باستخدام قالب النحاس مسخن مسبقا. تم استئصال eschar حرق واستبدالها مع الكسب غير المشروع سمك كامل حصادها من ذيل الماوس المانحة. هناك ثلاث مزايا رئيسية لهذا النموذج التجريبي. أولاً، قد يتم تحريض أكثر من جرح حرق على الجزء الخلفي من فأرة المتلقي، ويمكن حصاد أربعة طعوم جلدية من متبرع من ذيل واحد من الفأرة المانحة. وهذا يعني أنه قد يمكن مقارنة العديد من العلاجات التجريبية والمكافحة باستخدام نفس الحيوانات المتلقية والمتبرعة. اعتمادا على الطريق المطلوب من الإدارة، قد تشمل العلاج السيطرة الإدارة المحلية أو النظامية للسيارة أو السيطرة وهمي (على سبيل المثال، التطبيق الموضعي للمرهم، تحت الجلد، الحقن داخل الصفاق أو الحقن الوريدي من محلول). ثانياً، يمكن التحكم في توقيت العلاج ونقطة النهاية للتجربة. ثالثاً، يعتمد هذا النموذج على إعادة بناء الجروح باستخدام الطعوم الكاملة التي يتم حصادها من الذيل، والتي من المعروف أن لديها احتمال أعلى لدمجها بنجاح في موقع المانحة مقارنة بالجلد الذي تم حصاده من الخلف13. قد يكون هذا بسبب انخفاض عدد خلايا لانجرهانس البشرة ، والتي تلعب دورًا رئيسيًا في البيولوجيا المناعية الجلدية ، وترتبط برفض الكسب غير المشروع للجلد14.
النموذج المقترح لتضميد الجروح والتكامل الكسب غير المشروع قد يكون تطبيقها على الفئران المعدلة وراثيا و خروج المغلوب. وسيساعد استخدام الفئران المعدلة وراثيا في توضيح الأدوار التي قد تلعبها جينات معينة أثناء إصلاح الجروح. ويمكن أيضا أن ينظر في التطبيق الخارجية للمستحضرات الجرح الموضعي أو الإدارة تحت الجلد من الأجسام المضادة العلاجية في موقع الإصابة.
بسبب الصعوبات التقنية ، من الصعب الحصول على ترقيع الجلد ذات السماكة المقسمة المكونة من البشرة وجزء من الأدمة في الفئران. ومن المعروف أن الطعوم الجلد سمك كامل تتكون من البشرة والأدمة سمك كامل تتطلب سرير الجرح الأوعية الدموية بشكل جيد للاندماج الناجح. عدم القدرة على حصاد سمك سمك الجلد الطعوم في الفئران يمكن أن يعتبر تقييدا لهذا النموذج. تم تحقيق تثبيت الكسب غير المشروع للجلد على سرير الجرح المتلقي عن طريق تطبيق الغراء اللاصق الجراحي ، والذي يرتبط بأقل صدمة وتدهور سريع مقارنة بوسائل أخرى لتثبيت الأنسجة15. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن خياطة يرتبط مع أقوى تثبيت الأنسجة من الغراء الجراحي في 24 ح بعد إجراءجراحية 15, والتي يمكن اعتبارها عيبا في الإجراء. ومع ذلك ، في نقاط زمنية لاحقة ، تصبح القوة الحيوية الميكانيكية للجروح المعالجة لاصقة جراحية مماثلة لخياطة15 وأفضل من تثبيت الأساسية16. بعد تثبيت الأنسجة مع الغراء الجراحي ، يجب تغطية الجروح بخلع تضميد الجروح. على الرغم من أن الجروح على سطح الظهر من الفأرة من الصعب على الحيوان للوصول، من ناحية أخرى، من السهل على الحيوان التلاعب وإزالة الجرح. قد يكون هناك مبرر لتغييرات متكررة في تضميد الجروح.
التخدير الناجم عن انخفاض حرارة الجسم في القوارض الصغيرة هي ظاهرة موثقة جيدا17. انخفاض حرارة الجسم هو أحد الآثار الجانبية لهذا الإجراء، الذي يسبب مضاعفات، ويحتمل أن يعرض صحة الحيوان ونوعية البيانات للخطر. لذلك، هذه الطريقة تضمن تنفيذ استراتيجيات إدارة درجة الحرارة، خاصة إذا تم استخدام SKH1-Hrhr بدون شعر.
أهم قيد على استخدام الفئران لتقليد إغلاق الجرح البشري هو الفرق بين تشريح الجلد وعلم وظائف الأعضاء. تلتئم جراح الفأر في الغالب عن طريق الانكماش ، في حين أن الجروح البشرية تلتئم من خلال تكوين أنسجة التحبيب وإعادة الظهارة18. لحساب هذا التناقض، قد يتم تعديل النموذج الحالي واستخدامها في تركيبة مع حلقة جبيرة الالتزام بإحكام حول الجرح لمنع تقلص الجلد19. ونظرا لبعض المزايا والمساوئ من هذا في بروتوكول الجسم الحي، وهذا النموذج يمكن أن تكون بمثابة أداة لدراسة بعض العمليات التي تنطوي على التئام الجروح التي من المستحيل أن تدرس في المختبر.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل وزارة التعليم العالي والبحث الفرنسية (رقم الدراسة: 12216201711616517670v2 وDAP180012). وكانت جميع الفئران ذات مسكن واحد عند الوصول في أقفاص بلاستيكية وسمح لها بفترة تأقلم مدتها 7 أيام قبل الدراسة. تم الحفاظ على غرفة الحيوانات في دورة خفيفة / داكنة 12/12 ساعة (أضواء على الساعة 07:00). وتم توفير الطعام ومياه الصنبور الإعلانية libitum. تم تغذية فئران BALB/c و SKH1-Hrhr بالحمية التقليدية القائمة على القمح/الصويا. تم توفير فراش نشارة ا و مع مواد التعشيش.
1- إعداد المعدات
- إعداد جهاز حرق لهذا الإجراء وتعيينه إلى 80 درجة مئوية باستخدام وحدة تحكم درجة الحرارة (الشكل 1A). تحقق من درجة حرارة قالب النحاس (الشكل 1B، C) باستخدام كاميرا التصوير الحراري بالأشعة تحت الحمراء.
- تأكد من أن مقياس المسافة الرقمية يعمل بشكل صحيح.
- تغطية المرحلة مع الستائر الجراحية وضبط ارتفاع الجدول (الشكل 1A).
2- رعاية الحيوانات قبل الجراحة وداخل العملية
- الحصول على BALB / c وSKH1-Hrhr الفئران، 6-8 أسابيع من العمر.
- إضافة تعليق الباراسيتامول في 3 ملغ / مل لمياه الشرب والإمدادات 12 ساعة قبل وحتى 72 ساعة بعد العملية.
- باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 26 G، وإدارة البوبرينورفين تحت الجلد في 0.05 ميكروغرام / غرام 30 دقيقة قبل الإجراء وكل 6 ساعات لأول 72 ساعة بعد العملية.
- باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 26 G، وإدارة ليدوكاين إلى دورسوم من الماوس و 2-3 ملم من منطقة الجرح الحروق. حقن ليدوكاين في 0.05 ميكروغرام / ز تحت الجلد 15 دقيقة قبل تحريض الجرح الحروق.
- تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من الزيلازين في 10 ملغم / كغ والكيتامين 100 ملغ / كغ. استخدام حقنة 1 مل وإبرة 26 G لإدارة الحقن.
- الخطوة الحاسمة: ضع الماوس المُخدَّر على لوحة ساخنة وابق الماوس دافئًا لمنع انخفاض حرارة الجسم لأول 30 دقيقة بعد تحريض التخدير و15 دقيقة على الأقل بعد التعافي من التخدير. بالإضافة إلى وسادة ساخنة، ويمكن استخدام طرائق أخرى بما في ذلك المصابيح الحرارية،والسوائل الدافئة المتداولة أو الهواء، والخزانات الحرارة قبل تسخين لتنظيم درجة حرارة الجسم.
- تطبيق جل التشحيم على عيون الماوس لمنع جفاف القرنية.
- استخدام إصبع القدم قرصة منعكس الانسحاب لتقييم عمق التخدير.
- باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 26 G إدارة 200 ميكرولتر من الحل Ringer Lactated تكملها 5٪ dextrose. إدارة استبدال السوائل تحت الجلد مباشرة بعد تحريض التخدير و 6 ساعات بعد الإجراء لمنع الجفاف.
3. كامل سمك حرق الجرح التعريفي
- حلق الماوس المُخدر بقصات الشعر.
- تطبيق كريم depilating على سطح الظهر من الماوس لمدة 1 دقيقة. مسح قبالة كريم باستخدام بعض الشاش العقيمة وتنظيف المنطقة مع قطعة من الشاش رطبة. لطخة الجلد مع بعض الشاش حتى يجف.
- ضع الماوس على المسرح مغطى بستار جراحي وتحريك المرحلة إلى أعلى أقرب إلى قالب النحاس المُحمّى مسبقًا.
- تطبيق قالب النحاس دائري على الجزء الخلفي من الماوس (80 درجة مئوية لمدة 20 ق) باستخدام الضغط المستمر من 0.15 N(الشكل 2).
- خطوة هامة: مباشرة بعد الحث على حرق، ووضع الحيوان مخدر على وسادة ساخنة لمنع انخفاض حرارة الجسم والحفاظ على الماوس دافئة أثناء وبعد الإجراء. بمجرد استردادها من التخدير، والعودة الماوس مرة أخرى إلى القفص.
- خطوة هامة: توفير نظام غذائي مهروس على أرضية القفص لأول 72 ساعة بعد إجراء العمليات الجراحية. وتتردد الفئران في بعض الأحيان في الوصول إلى أنبوب رشق لشرب الماء بعد إصابة جرح الحروق.
4- حصاد الكسب غير المشروع من المانحين
- جعل شق طولي مع مشرط في الجزء العلوي من ذيل الماوس المانحة وإزالة بلطف الجلد باستخدام ملقط الجراحية.
- ضع جلد الذيل في طبق بيتري معقمة مليئة 10 مل من محلول ملحي معقمة 0.9٪. استخدام مسطرة لقياس الطعوم الفردية وقطع الجلد الذيل إلى قطع، كل قياس 15 ملم، وذلك باستخدام مشرط.
- مرة واحدة على استعداد، والحفاظ على الطعوم الجلد في محلول ملحي 0.9٪ في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 ساعة.
5. الختان الجراحي وتطعيم الجلد
- بعد 24 ساعة من الحث على الحرق ، قم بإعداد الماوس للتخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. ضع الفأر في غرفة الحث والحث على التخدير باستخدام 5٪ isoflurane في 100٪ من الأكسجين بمعدل تدفق 4 لتر / دقيقة. للحفاظ على التخدير أثناء الجراحة، استخدم 2٪ ايزوفلوران في 2 لتر / دقيقة.
- وضع الستائر الجراحية على الماوس وقطع نافذة لفضح المجال الجراحي. باستخدام تقنية معقمة، مسحة الجرح أولاً مع بوديوني اليود ومن ثم مع الكحول 70٪.
- التقط بلطف الأنسجة المحروقة مع زوج من ملاقط الجراحية ومكوس جميع الأنسجة النخرية وغير القابلة للحياة مع مقص جراحي معقمة وملاقط. إزالة طبقة كارنوسوس panniculus من hypodermis لإنشاء سرير المتلقي مستقرة.
- ضع ترقيع الجلد على سرير الجرح المعد حديثًا. اسحب الجلد المحيط برفق نحو ترقيع الجلد باستخدام ملاقط جراحية. تطبيق بعض لاصق الجراحية لإرفاق الكسب غير المشروع إلى السرير الجرح واضغط بلطف لمحاذاة حواف الجلد. الخطوة الحاسمة: يجب أن يكون حجم سرير الجرح أكبر بقليل من حجم الطعم الجلدي لضمان نجاح الطعم.
- السماح للماوس للتعافي من التخدير. خطوة حرجة: ضع الماوس على وسادة ساخنة. الحفاظ على الماوس دافئة أثناء وبعد الإجراء لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- تطبيق خاملة البارافين الشاش خلع الملابس وصلصة الثانوية لاصقة على الجرح المطعمة.
- ضع الماوس في قفص فردي. الخطوة الحاسمة: توفير بعض النظام الغذائي المهروس على أرضية القفص لأول 72 ساعة بعد إجراء الجراحة ومراقبة يوميا.
- توفير الألعاب وإثراء البيئة.
6- التصوير الرقمي وجمع الجروح بعد الوفاة
- صور الجروح بكاميرا رقمية بوضع مسطرة بجانب الجرح(الشكل 3).
- في نهاية التجربة، قتل الحيوانات عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون وخلع عنق الرحم. الخطوة الحرجة: الإفراط في سحب عمل الجلد أثناء خلع عنق الرحم قد يضر الكسب غير المشروع.
- في مرحلة ما بعد الوفاة، استئصال جراحيا الجروح حرق الظهرية إلى اللفافة باستخدام مقص. جروح بيزكت. إصلاح نصف في 10٪ bufferin ولمعالجة الأنسجة والكيمياء المناعية. تجميد سريع النصف الآخر في النيتروجين السائل لاستخراج الحمض النووي الريبي وكمية البروتين والحفاظ على -80 درجة مئوية.
7. علم الأنسجة الجلد، المناعة الكيمياء والكولاجين التصور
- تضمين عينات من الجلد في البارافين، وقطع إلى 4 ميكرومتر أقسام ووضعها على الشرائح مشحونة إيجابيا.
- استخدم الشرائح الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوسين لتقييم معدل إعادة الظهارة (٪ من الجرح الأصلي). ويمكن التعبير عن مساحة الجرح المغطى بشرة البشرة الجديدة كنسبة مئوية من كامل الجرح(الشكل 4). استخدام تطبيق المجهر الرقمي وبرنامج ImageJ لإجراء التحليل المجهري لأبواب.
- استخدم أقسام النسيج (4 ميكرومتر سماكة) المعدة من الأنسجة الثابتة وغير الثابتة في البارافين وإخضاعها للكيمياء المناعية.
- لتقييم الكولاجين الأول وتعبير فيبرومينكتين في الجروح، وتطبيق الأجسام المضادة الأولية واحتضان ل 1 ح. يمكن أن يتم الكشف عن طريق الأنواع المحددة بيروكسيديز الفجل (HRP) أو فوسباتيز القلوية (AP)-متقارن الأجسام المضادة الثانوية.
- تتفاعل المقاطع إما: (ط) HRP،3،3'-diaminobenzidine (DAB) أو (2) ا ف ب، بوند بوليمر صقل الأحمر (جدول المواد)، الذي ينتج لون أحمر مشرق (الشكل 5). مسح المقاطع باستخدام أداة وتحليل مع تطبيق المجهر الرقمي وImageJ.
- لتمكين التقييم النسيجي لترسب الكولاجين، قم بإجراء تلطيخ ثلاثي اللون على أقسام النسيج باستخدام مجموعة أدوات تجارية.
- للتصور الألياف الكولاجين، واستخدام المجهرية متعددة الصور وتقنية الجيل التوافقي الثاني(الشكل 5). استخدام مجهر متعدد الصور لتصوير الأنسجة كما سبق وصفه20. استخدام ليزر Ti:Sapphire مع طول موجي مركز في 810 نانومتر كمصدر ليزر لتوليد الثاني التوافقي واثنين من الضوين متحمس الفلورنس إشارات (TPEF).
- استخدم شعاع ليزر مزودًا بهدف 25x/0.95 W لجمع وإثارة الجيل التوافقي الثاني (SHG) و TPEF. الكشف عن الإشارات كما هو موضح سابقا21 من قبل كاشفات PMT NDD. استخدام البرمجيات بالليزر التحكم في المسح الضوئي واقتناء الصور.
Representative Results
النتائج تثبت أن البروتوكول وضعت هو طريقة واضحة، والتي تسمح التعريفي من حرق كامل سمك الجرح في الفئران. يتم حث الحروق باستخدام قالب نحاسي محمّى مسبقًا (الشكل 1A-C). تظهر المنطقة المحترقة كجرح دائري مع إسشار أبيض ومنطقة فرط في الدم. حجم الجرح الحروق أكبر قليلا في 24 ساعة بعد إصابة الحروق نتيجة للظاهرة الموصوفة جيدا المعروفة باسم تطور إصابة الحروق، والتي ربما يرجع ذلك إلى التهاب حاد22. بعد الختان، يتم إعادة بناء الجروح حرق باستخدام الطعم الجلد الوهن(الشكل 3). في اليوم 7 بعد إصابة الحروق ، تصبح الجروح5، وهو مؤشر على نجاح النقش. تهاجر خلايا الكيراتينوس البشرة من جلد المتلقي المجاور في محاولة لإغلاق الجرح وسد الفجوة بين حواف الجروح. وكشف التحليل المجهري للحاء و E مقطع ملطخ من الجروح أن طول البشرة الجديدة يصبح أطول بكثير في اليوم 7 بعد إصابة الحروق مقارنة باليوم 3 بعد إصابة الحروق (الشكل 4B). قبل إجراء دراسة كبيرة، يوصى بشدة بأن يقوم الباحثون بإكمال دراسة تجريبية، مما يتيح استكشاف تدخل جديد، وتقييم الجدوى، وتحديد التعديلات على الطريقة لضمان قابلية التكاثر. يصعب اكتشاف التأثيرات ذات الأهمية الإحصائية في العينات الأصغر، في حين أن زيادة حجم العينة هو إحدى الطرق لتعزيز القوة الإحصائية للاختبار. على سبيل المثال، لاكتشاف فرق مهم إحصائياً (p < 0.05) في معدل إعادة الظهارة للجرح(الشكل 4)بين المجموعات، يجب أن يكون حجم العينة بين ستة وثمانية فئران لكل مجموعة. يجب تكرار جميع التجارب مرتين على الأقل. كما مصفوفة الخلايا المنتجة، مثل الخلايا الليفية، والهجرة من الأنسجة المتلقي في الكسب غير المشروع، والمكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية، بما في ذلك الكولاجين الأول والليفي تصبح صريحة للغاية في المصفوفة التي شكلت حديثا(الشكل 5).
الشكل 1: حرق جهاز الإعداد. (A) وضع وإعداد الجهاز حرق. يتم توصيل جهاز الحرق بجهاز التحكم في درجة الحرارة ويتم إرفاقه بمقياس الإشعال الرقمي لتمكين مراقبة الضغط. يتم تعليق الجهاز حرق فوق مرحلة قابلة للتعديل – سطح مستو على الفئران التي توضع لالتحث على حرق. (B-C) صورة عن قرب من قالب النحاس تستخدم للحث على حروق الجرح. (C ) قطر قالب النحاس هو 1 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. C
الشكل 2: رسم توضيحي تخطيطي لمختلف الخطوات المطلوبة لإعادة إنتاج النموذج التجريبي الموصوف في هذه المقالة. هناك ثلاث خطوات رئيسية لإجراء: '1' تحريض الجرح حرق باستخدام نموذج النحاس محمّى؛ '2' الختان الجراحي للأنسجة النخرية غير القابلة للحياة بعد 24 ساعة من إصابة الحروق؛ '3' إعادة بناء الجروح الجراحية باستخدام سمك كامل الجلد الطعم اللينجيني حصادها من الماوس المانحة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المنظر العياني لجروح حرق الماوس المعاد بناؤها. صور رقمية تمثيلية لجروح الحروق التي أعيد بناؤها مع ترقيع الجلد الالجيني في الأيام 0 و 1 و 3 و 7 بعد إصابة الحروق. المسطرة على الصور في ملليمتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ظهور مجهري للجروح في 3 و 7 أيام بعد إصابة الحروق. H & E-ملطّخ أقسام من الجروح 3 و 7 أيام بعد إصابة الحروق. طول البشرة الجديدة (خط منقط) هو زيادة كبيرة في (أ) اليوم 3 الجروح مقارنة مع (B) اليوم 7 الجروح. في (A) و (B) ، شريط المقياس هو 100 ميكرومتر (C) تمثيل رسومي للنسبة المئوية للجرح إعادة الظهارة. تم تقييم هذا من خلال قياس طول البشرة الجديدة في اليوم 3 و 7 إصابة بعد الحروق ويعبر عنها كنسبة مئوية من طول الجرح كله. تمثل النتائج متوسط ± S.E.M. (n = 6 فئران في اليوم 3 مجموعة؛ ن = 6 فئران في اليوم 7 مجموعة، *p < 0.05; الطالب t اختبار). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تقييم المصفوفة خارج الخلية والكولاجين الأول التصور. صور تمثيلية لتحليل المناعة في اليوم 7 ماوس الجروح الملطخة لـ (A) الكولاجين و (B) fibronectin. لاحظ تلطيخ أحمر مكثف في خلايا الكولاجين على شكل مغزل ممدود I-positive. لاحظ تلطيخ بني في الخلايا الإيجابية الليفية في الأدمة من جراح اليوم 7. شريط مقياس = 50 ميكرومتر في جميع الصور. في (A) و (B) ، ه يدل على البشرة و د يدل على الأدمة. (C) التصور من ألياف الكولاجين والتقييم النسيجي لترسب الكولاجين. (D) ممثل TPEF / SHG صورة الكولاجين من اليوم 7 الجروح الماوس. تم معالجة عملية الاستحواذ المتزامنة على TPEF/SHG باستخدام الاستقطاب الدائري وإشارات SHG بشكل انتقائي للحصول على توزيع ثنائي من مجموعة SHG بعد تطبيق عتبة. كانت صور TPEF (الأخضر) وصور SHG (بيضاء) زائفة اللون ومضاف. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وفقا لتصنيف سمك إصابة الحروق23، تتميز الحروق الكاملة بسماكة المشاركة الواضحة لسمك الجلد كله وجزء معين من الأنسجة تحت الجلد. هذا النوع من الجرح يمكن أن تلتئم فقط عن طريق الانكماش أو مع الجلد تطعيم2. وهناك قيود متأصلة من الطريقة الموصوفة في هذه المقالة هو أن الطعوم سمك كامل فقط، بدلا من الطعوم سمك الانقسام، والتي غالبا ما تستخدم في الإعداد السريري، تم حصادها من ذيل الماوس. ويرجع ذلك إلى صعوبة التقنية، كما جلد الماوس رقيقة جدا للحصول على الطعوم سمك الانقسام. تجدر الإشارة إلى أن الطعوم الكاملة التي تتطلب أوعية السرير الجرح جيدا، في حين أن سمك سمك الجلد الطعوم الانقسام قادرة على البقاء على قيد الحياة في مواقع المانحة مع أقل الأوعية الدموية24. وأظهرت الدراسات السابقة أن الجرح الناجم عن حرق على الجزء الخلفي من الماوس كان مرتبطا بتشكيل قوي من الأوعية الدموية الجديدة5. وهذا يشير إلى أن منطقة الأوعية الدموية بشكل جيد، مثل دورسوم الماوس، يمكن اعتبارها معلم تشريحي لتحريض الجروح الحروق.
حرق عمق الجرح هو عامل مهم للنظر. يجب أن يكون عمق الجرح الحروقي متناسقاً بين الفئران الفردية. يعتمد تكرار عمق جرح الحروق على درجة حرارة القالب النحاسي والضغط ومدة التعرض للحرارة. يجب التحقق من عمق جرح الحرق من الناحية النسيجية. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الضغط المفرط أو التعرض لفترات طويلة من الجلد إلى قالب النحاس المسخ قد يجرح الأنسجة الأساسية. الأنسجة المحيطة العمود الفقري, بما في ذلك مكونات الجهاز العصبي المركزي والمحيطي, حساسة للحرارة, وإذا تلف قد يؤدي إلى الشلل في الساق الخلفية.
على الرغم من عدم وجود وفيات بعد الجراحة ارتبطت مباشرة مع الإجراء الجراحي، وعدد قليل من الفئران SKH1-Hrhr بلا شعر، والتي هي حساسة بشكل خاص للبرد، وضعت انخفاض حرارة الجسم وفشلت في التعافي بعد التخدير العام. لذلك، يجب توفير الحرارة التكميلية خلال جميع الأحداث الجمالية، ويلزم مراقبة مستمرة في حين يتم تخدير الماوس.
لم تكن الطريقة الموصوفة في هذه الدراسة مرتبطة بعدوى الموقع الجراحي. ومع ذلك ، يجب استخدام تقنية معقمة لمنع نقل الكائنات الدقيقة إلى الجرح الجراحي خلال فترة ما حول العملية. قد يتم دمج تلقيح الجرح مع الكائنات الحية الدقيقة الإنارة الحيوية أو الفلورسنت في الإجراء. قد تكون هذه التقنية مفيدة في دراسة الكائنات المعدية و مسبباتهاالمرضية 25. على سبيل المثال، إضافة خارجية أو حقن البكتيريا الإنارة الحيوية، قد تسمح برصد العبء الميكروبي باستخدام في الجسم الحي تصوير الحيوانات كله25. وبالنظر إلى أن شعر الماوس معروف بالتدخل في الفلور الحيوانية الكاملة في الجسم الحي وتصوير الإضاءة الحيوية ، فإن فئران SKH1-Hrhr عديمة الشعر هي المضيفين المثاليين للدراسات التي تنطوي على المراسلين الفلورسنت أو الإنارة الحيوية.
يمكن جمع عينات من نسيج الجرح في نقاط زمنية مختلفة ومعالجتها للتحليل النسيجي والمناعة الكيميائية. قد تكون معزولة البروتين والرنا من الجلد خزعة وتقنيات البيولوجيا الجزيئية يمكن استخدامها لتقييم التعبير عن الجزيئات الرئيسية التي تشارك في التئام الجروح.
في هذه الدراسة، وصفنا نموذجا تجريبيا لتضميد الجروح حرق وengraftment الجلد الوهن. يمكن تعديل هذا الإجراء ويكون بمثابة نموذج للدراسات قبل الكلينيكية.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل "لا دايركشن جنرال جنرال دي لارميم" و"وكالة الابتكار في الدفاع" و"معهد التكنولوجيات المتعددة". نشكر زميلنا السيد يان بلانتييه من École Polytechnique الذي قدم البصيرة والخبرة التي ساعدت بشكل كبير في إنتاج ملف الفيديو. يشكر المؤلفان السيد بنوا بويتمان والسيدة شارلوت أوريو من INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33، Hôpital Paul Brousse، Villejuif على رفاهية الحيوانات وخبرة الرعاية المقدمة خلال هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
| Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
| Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
| Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
| Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Depilating cream | Veet | ||
| Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
| Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
| Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Heating pad | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
| Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
| LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
| Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
| Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm France | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
| Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
| SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
| Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
| Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
| Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |
References
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G.
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).
