Бактериальная устная кормление с помощью антибиотико-обработанных комаров
Summary
В этой статье представлен протокол для исследования влияния отдельных бактерий комаров кишечника, в том числе изоляции и выявления комаров midgut культивирования микробов, антибиотик истощения бактерий кишечника комаров, и вновь ввести один конкретный вид бактерий.
Abstract
Комар midgut гавани высоко динамичный микробиом, который влияет на метаболизм хозяина, размножение, фитнес, и вектор компетенции. Были проведены исследования для исследования влияния кишечных микробов в целом; однако, различные микробы могут оказывать различные эффекты по отношению к хозяину. В данной статье приводится методология изучения влияния каждого конкретного микроба кишечника комаров и потенциального механизма.
Этот протокол содержит две части. Первая часть вводит, как вскрыть комаров midgut, изолировать сорта бактерий колоний, и определить виды бактерий. Вторая часть предусматривает процедуру генерации обработанных антибиотиками комаров и повторного введения одного конкретного вида бактерий.
Introduction
Комары считаются наиболее важными переносчиками патогенных заболеваний человека, передающих более ста патогенных микроорганизмов, включая вирус Зика, вирус Денге и паразиты Plasmodium 1. Когда комары принимают пищу крови, чтобы приобрести питательные вещества для овипозиции, они могут случайно ingest патогенов из инфицированного хозяина через пищеварительныйтракт 2. Важно отметить, что комаров midgut, который играет ключевую роль в обоих пищеварения еды крови и патогенных входов, гавани очень динамичный микробиом3.
Несколько исследований характеризовали лабораторных и полевых собранных микробиот комаров с использованием либо культурозависимый метод или бактерии секвенированияанализа 4,5,6. Виды, включая Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, и Enterococcus обычно изолированы от комаров вразличных исследованиях 5,7,8,9. Интересно, что микробиота кишечника комаров динамически колеблется как в разнообразии сообщества, так и в количестве видов бактерий, затронутых стадией развития, видом, географическим происхождением иповедением кормления 4. Исследования показывают, что кормление крови резко увеличивает общую бактериальную нагрузку с быстрым расширением видов из Enterobacteriaceae и сокращениеобщего разнообразия 10,11. Кроме того, микробиота кишечника комаров личиновидной стадии обычно искореняется, когда насекомое подвергается метаморфозе во время окукливания и эклоции; таким образом, вновь возникшие взрослые комары должны заселить свою микробиоту4.
Микробиота кишки модулирует физиологию насекомых в различных аспектах, включая усвоение питательных веществ, иммунитет, развитие, размножение и векторнуюкомпетентность 12. Axenic личинки комаров не в состоянии развиваться за пределами первой instar в то время как бактерии устные поставки спасает развитие, указывая, что комаров кишечника микроб имеет важное значениедля развития личинки 13,14. Кроме того, истощение кишечных бактерий замедляет пищеварение пищи в крови и усвоение питательных веществ, влияет на созревание яйцеклеток и уменьшает овипозицию15. Кроме того, комары с микрофлорой кишечника вызывают более высокие иммунные реакции по сравнению с обработанными антибиотиками комарами, с постоянно повышенным экспрессией антимикробных пептидов противдругих патогенов, чтобы заразить 16. Антибиотики, как правило, устно вводят для удаления бактерий пан кишечника в этих исследованиях, а затем эксперименты проводятся, чтобы сравнить разницу между топором комаров и комаров с commensal микробов. Тем не менее, комар midgut гавани разнообразное сообщество микробов, и каждый вид бактерий может оказать явное влияние на физиологию хозяина.
Микробиота комаров регулирует векторную компетентность с различными эффектами. Колонизация Proteus изолированы от полевых комаров денге эндемичных районах придает до регулируется антимикробных пептид экспрессии и устойчивость к инфекции вирусаденге 16. Энтомопатогенный гриб Beauveria bassiana активирует иммунный путь Toll и JAK-STAT против арбовирусной инфекции17. В отличие от этого, гриб Talaromyces изолированы от Aedes aegypti midgut облегчает вирус денге инфекции путем модуляции кишечника трипсинадеятельности 18. Кроме того, Serratia marcescens способствует передаче арбовируса через секреторный белок под названием SmEnhancin ,который переваривает слой муцина на кишечном эпителиикомаров 19.
Эта процедура обеспечивает систематический и интуитивный метод для вскрытия комаров мидгут, изоляция обетуемых колоний бактерий, выявление видов бактерий, и реинтродукции через устное кормление. Он обеспечивает репрезентативные результаты кормления крови с commensal бактерии, Chryseobacterium менингосептикум, на комаров яичников развития и овипозиции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования взаимодействия хост-микробов показали, что различные кишечные микробы влияют на физиологию хозяина с помощью различных механизмов. Эта статья вводит метод для того чтобы исследовать соответственно роль микроба кишки москита, включая вскрывать midgut москита, культивироват…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 81902094, 81600497) и Научно-технический план проекта провинции Хунань (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
