Un saggio di alimentazione orale batterico con zanzare trattate con antibiotici
Summary
Questo articolo presenta un protocollo per studiare l’effetto dei singoli batteri dell’intestino di zanzara, tra cui l’isolamento e l’identificazione di microbi cultivable delle zanzare, l’esaurimento antibiotico dei batteri dell’intestino di zanzara e reintrodurre una specie di batteri specifici.
Abstract
La zanzara midgut ospita un microbioma altamente dinamico che influenza il metabolismo dell’ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza vettoriale. Sono stati condotti studi per studiare l’effetto dei microbi intestinali nel loro complesso; tuttavia, microbi diversi potrebbero esercitare effetti distinti verso l’ospite. Questo articolo fornisce la metodologia per studiare l’effetto di ogni microbo specifico dell’intestino di zanzara e il potenziale meccanismo.
Questo protocollo contiene due parti. La prima parte introduce come sezionare la zanzara midgut, isolare colonie batteriche cultivable, e identificare le specie di batteri. La seconda parte fornisce la procedura per generare zanzare trattate con antibiotici e reintrodurre una specie di batteri specifici.
Introduction
Le zanzare sono considerate i vettori più importanti delle malattie patogene umane, trasmettendo oltre un centinaio di patogeni tra cui il virus zoika, il virus Dengue e i parassiti del Plasmodium 1. Quando le zanzare prendono un pasto di sangue per acquisire nutrienti per l’oviposizione, possono accidentalmente ingerire agenti patogeni da un ospite infetto tramite il tratto digestivo2. È importante sottolineare che la zanzara midgut, che svolge un ruolo fondamentale sia nella digestione dei pasti sanguigni che nell’ingresso di agenti patogeni, ospita un microbiomaaltamente dinamico 3.
Diversi studi hanno caratterizzato il microbiota di zanzara allevato in laboratorio e raccolto sul campo utilizzando un metodo dipendente dalla coltura o un asquencing di sequenziamentobatterico 4,5,6. Specie tra cui Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, e Enterococcus sono comunemente isolati dalle zanzare in varistudi 5,7,8,9. È interessante notare che il microbiota dell’intestino di zanzara fluttua dinamicamente sia nella diversità della comunità che nella quantità di specie batteriche, influenzate dalla fase di sviluppo, dalle specie, dall’origine geografica e dal comportamento alimentare4. Gli studi dimostrano che l’alimentazione del sangue aumenta drammaticamente il carico batterico totale con una rapida espansione delle specie da Enterobacteriaceae e una riduzione della diversitàcomplessiva 10,11. Inoltre, il microbiota intestinale della zanzara dello stadio larvale viene solitamente sradicato quando l’insetto subisce la metamorfosi durante la pupazione e l’eclosione; quindi, le zanzare adulte appena emerse hanno bisogno di ripopolare il loro microbiota4.
Il microbiota intestinale modula la fisiologia degli insetti in vari aspetti, tra cui l’assorbimento dei nutrienti, l’immunità, lo sviluppo, la riproduzione e la competenzavettoriale 12. Le larve di zanzara ascia non riescono a svilupparsi oltre la prima instar mentre un approvvigionamento orale batterico salva lo sviluppo, indicando che il microbo intestinale della zanzara è essenziale per lo sviluppo larvale13,14. Inoltre, l’esaurimento dei batteri intestinali ritarda la digestione dei pasti nel sangue e l’assorbimento dei nutrienti, influisce sulla maturazione degli oociti e diminuisce l’oviposizione15. Inoltre, le zanzare con microflora intestinale suscitano risposte immunitarie più elevate rispetto alle zanzare trattate con antibiotici, con espressione di peptidi antimicrobici costantemente elevata contro altri patogeni perinfettare 16. Gli antibiotici sono di solito somministrati per via orale per rimuovere i batteri intestinali pan in questi studi, e poi vengono condotti esperimenti per confrontare la differenza tra zanzare asceniche e zanzare con microbi commensal. Tuttavia, la zanzara midgut ospita una comunità diversificata di microbi, e ogni specie di batteri potrebbe esercitare un effetto distinto verso la fisiologia ospite.
Il microbiota delle zanzare regola la competenza vettoriale con effetti divergenti. La colonizzazione da parte di Proteus isolato dalle zanzare derivate dal campo delle aree dengue-endemiche conferisce l’espressione di peptidi antimicrobici e la resistenza contro l’infezione da virus dengue16. Il fungo entomopatogenico Beauveria bassiana attiva il percorso immunitario Toll e JAK-STAT contro l’infezione da arbovirus17. Al contrario, il fungo Talaromyces isolato da Aedes aegypti midgut facilita l’infezione da virus dengue modulando l’attività di trypsinaintestinale 18. Inoltre, Serratia marcescens promuove la trasmissione dell’arbovirus attraverso una proteina secretoria chiamata SmEnhancin, che digerisce lo strato di mucina sull’epitelio intestinale delle zanzare19.
Questa procedura fornisce un metodo sistematico e intuitivo per la dissezione della zanzara midgut, l’isolamento delle colonie di batteri cultizzabili, l’identificazione delle specie batteriche e la reintroduzione tramite alimentazione orale. Fornisce risultati rappresentativi dell’alimentazione del sangue con un batterio commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sullo sviluppo dell’ovaio delle zanzare e sull’oviposizione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricerca sulle interazioni ospite-microbi ha scoperto che diversi microbi intestinali influenzano la loro fisiologia ospite attraverso meccanismi divergenti. Questo articolo introduce il metodo per studiare il rispettivo ruolo del microbo intestinale della zanzara, tra cui sezionare la zanzara midgut, culturing batteri intestinali culti, trattamento antibiotico, e reintrodurre i batteri di interesse.
Per un trattamento antibiotico di successo, i seguenti dettagli devono essere considerati ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), e dal Science and Technology Plan Project della provincia di Hunan (2019RS1036).
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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