Denne artikel præsenterer en protokol til at undersøge effekten af de enkelte myg tarmbakterier, herunder isolering og identifikation af myg midgut kultivable mikrober, antibiotika udtynding af myg tarmbakterier, og genindføre en bestemt bakterie arter.
Myg midgut havne en meget dynamisk mikrobiom, der påvirker værten stofskifte, reproduktion, fitness, og vektor kompetence. Der er gennemført undersøgelser for at undersøge virkningen af tarmmikrober som helhed; forskellige mikrober kan dog have forskellige virkninger over for værten. Denne artikel indeholder metoden til at undersøge effekten af hver enkelt myg gut mikrobe og den potentielle mekanisme.
Denne protokol indeholder to dele. Den første del introducerer, hvordan man dissekere myg midgut, isolere kultivable bakterier kolonier, og identificere bakterier arter. Den anden del giver mulighed for at generere antibiotika-behandlede myg og genindføre en bestemt bakterie arter.
Myg anses for at være de vigtigste vektorer af humane patogene sygdomme, overføre over hundrede patogener, herunder Zika virus, Dengue virus, og Plasmodium parasitter1. Når myg tage et blodmåltid at erhverve næringsstoffer til oviposition, de kan ved et uheld indtage patogener fra en inficeret vært via fordøjelseskanalen2. Vigtigere, myg midgut, som spiller en afgørende rolle i både blod måltid fordøjelse og patogen indgang, havne en meget dynamisk mikrobiom3.
Flere undersøgelser har karakteriseret lab-opdrættet og felt-indsamlet myg mikrobiota ved hjælp af enten en kultur-afhængig metode eller en bakterie sekventering assay4,5,6. Arter, herunder Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, og Enterococcus er almindeligvis isoleret fra myg i forskelligeundersøgelser 5,,7,,8,9. Interessant, myg gut mikrobiota svinger dynamisk i både samfundet mangfoldighed og mængden af bakterier arter, påvirket af udviklingsstadiet, arter, geografisk oprindelse, og fodring adfærd4. Undersøgelser viser, at blodfodring dramatisk øger den samlede bakteriebelastning med hurtig ekspansion af arter fra Enterobacteriaceae og en reduktion i den samledemangfoldighed 10,11. Desuden er mygge gut mikrobiota af larve fase normalt udryddet, når insektet gennemgår metamorfose under pupation og eclosion; således, nyligt opstået voksne myg nødt til at genbefolke deres mikrobiota4.
Gut mikrobiota modulerer insekt fysiologi i forskellige aspekter, herunder næringsstof absorption, immunitet, udvikling, reproduktion, og vektor kompetence12. Axenic myg larver undlader at udvikle sig ud over den første instar, mens en bakterier oral forsyning redder udvikling, hvilket indikerer, at myg tarmmikrobe er afgørende for larveudvikling 13,,14. Udover, udtynding af tarmbakterier forsinker blod måltid fordøjelse og næringsstof absorption, påvirker oocyt modning, og nedsætter oviposition15. Desuden fremkalder myg med tarmmikroflora højere immunrespons sammenlignet med antibiotikabehandlede myg, med konstant forhøjet antimikrobielt peptid udtryk mod andre patogener til at inficere16. Antibiotika er normalt oralt administreres for at fjerne pan tarmbakterier i disse undersøgelser, og derefter eksperimenter udføres for at sammenligne forskellen mellem axenic myg og myg med commensal mikrober. Men myg midgut havne et mangfoldigt fællesskab af mikrober, og hver bakterie arter kunne udøve en særskilt effekt mod værten fysiologi.
Mosquito microbiota regulerer vektor kompetence med divergerende virkninger. Kolonisering af Proteus isoleret fra felt-afledte myg af dengue-endemiske områder giver opreguleret antimikrobiel peptid udtryk og resistens over for dengue virus infektion16. Den entomopathogenic svamp Beauveria bassiana aktiverer Toll og JAK-STAT immun vej mod arbovirus infektion17. Derimod svampen Talaromyces isoleret fra Aedes aegypti midgut letter dengue virus infektion ved modulerende gut trypsin aktivitet18. Desuden, Serratia marcescens fremmer arbovirus transmission gennem en sekretorisk protein kaldet SmEnhancin, som fordøjer mucin lag på tarm epitel af myg19.
Denne procedure giver en systematisk og intuitiv metode til dissektion af myg midgut, isolering af kultivable bakterier kolonier, identifikation af bakteriearter, og genindførelse via oral fodring. Det giver repræsentative resultater af blod fodring med en commensal bakterie, Chryseobacterium meningosepticum, om myg æggesting udvikling og oviposition.
Forskning i vært-mikrobe interaktioner har vist, at forskellige tarm mikrober påvirker deres vært fysiologi via divergerende mekanismer. Denne artikel introducerer metoden til at undersøge den respektive rolle myg gut mikrobe, herunder dissekere myg midgut, dyrkekultebare tarmbakterier, antibiotikabehandling, og genindføre bakterier af interesse.
For vellykket antibiotikabehandling skal følgende detaljer overvejes ved udførelsen af forsøget. I denne protokol blev myg behandlet med vatk…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497), og Science and Technology Plan Project of Hunan Province (2019RS1036).
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
Cotton balls | |||
Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g; Agar 15.0 g. |
LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g; Yeast Extract 5.0 g; NaCl 10.0 g. |
Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
Paper cup | Place mosquito | ||
Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
Single Channal Pipettor | Gilson | ||
Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |