एंटीबायोटिक-इलाज मच्छरों के साथ एक बैक्टीरियल ओरल फीडिंग परख
Summary
यह लेख व्यक्तिगत मच्छर आंत बैक्टीरिया के प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें अलगाव और मच्छर मिडगट कृषि योग्य रोगाणुओं की पहचान, मच्छर आंत बैक्टीरिया की एंटीबायोटिक कमी, और एक विशिष्ट बैक्टीरिया प्रजातियों को फिर से पेश करना शामिल है।
Abstract
मच्छर मिडगुट एक अत्यधिक गतिशील माइक्रोबायोम बंदरगाहों कि मेजबान चयापचय, प्रजनन, फिटनेस, और वेक्टर क्षमता को प्रभावित करता है । पूरे पेट रोगाणुओं के प्रभाव की जांच करने के लिए अध्ययन किए गए हैं; हालांकि, विभिन्न रोगाणु मेजबान की ओर अलग प्रभाव डाल सकते हैं। यह लेख प्रत्येक विशिष्ट मच्छर आंत माइक्रोब और संभावित तंत्र के प्रभाव का अध्ययन करने की कार्यप्रणाली प्रदान करता है।
इस प्रोटोकॉल के दो भाग होते हैं। पहला भाग मच्छर मिडगुट को विच्छेदन करने, कृषि योग्य बैक्टीरिया उपनिवेशों को अलग करने और बैक्टीरिया प्रजातियों की पहचान करने का परिचय देता है। दूसरा भाग एंटीबायोटिक-उपचारित मच्छरों को उत्पन्न करने और एक विशिष्ट बैक्टीरिया प्रजातियों को फिर से शुरू करने की प्रक्रिया प्रदान करता है।
Introduction
मच्छरों को मानव रोगजनक रोगों का सबसे महत्वपूर्ण वैक्टर माना जाता है, जो जीका वायरस, डेंगू वायरस और प्लाज्मोडियम परजीवी1सहित सौ से अधिक रोगजनकों को प्रसारित करता है। जब मच्छर अंडाशय के लिए पोषक तत्व प्राप्त करने के लिए रक्त भोजन लेते हैं, तो वे गलती से पाचन तंत्र2के माध्यम से संक्रमित मेजबान से रोगजनकों को निगल सकते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि मच्छर मिडगुट, जो रक्त भोजन पाचन और रोगजनक प्रवेश द्वार दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, एक अत्यधिक गतिशील माइक्रोबायोम3बंदरगाहों ।
कई अध्ययनों में संस्कृति पर निर्भर विधि या बैक्टीरिया अनुक्रमण परख4,,5,,6का उपयोग करके प्रयोगशाला-पाला और क्षेत्र-एकत्र मच्छर माइक्रोबायोटा की विशेषता है। 5 ,,7,,,8,9विभिन्न अध्ययनों में पेंटोइया, सेराटिया5, क्लेबसिला, एलिजाबेथकिंगियाऔर एंटोकोकस सहित प्रजातियां आमतौर पर मच्छरों से अलग हैं । दिलचस्प बात यह है कि मच्छर आंत माइक्रोबायोटा दोनों समुदाय विविधता और बैक्टीरिया प्रजातियों की मात्रा में गतिशील रूप से उतार-चढ़ाव, विकास चरण, प्रजातियों, भौगोलिक मूल, और खिला व्यवहार4से प्रभावित है । अध्ययनों से पता चलता है कि रक्त आहार से आंत्रप्रेन्योर से प्रजातियों के तेजी से विस्तार और समग्र विविधता में कमीके,साथ कुल जीवाणु भार में नाटकीय रूप से वृद्धि होतीहै। इसके अलावा, लार्वा चरण के मच्छर आंत माइक्रोबायोटा को आमतौर पर खत्म कर दिया जाता है जब कीट पिल्ला और प्रकाश के दौरान कायापलट से गुजरती है; इस प्रकार, नए उभरा वयस्क मच्छरों को अपने माइक्रोबायोटा4फिर से आबाद करने की जरूरत है .
आंत माइक्रोबायोटा विभिन्न पहलुओं में कीट शरीर विज्ञान को संशोधित करता है, जिसमें पोषक तत्व अवशोषण, प्रतिरक्षा, विकास, प्रजनन और वेक्टर क्षमता12शामिल हैं। एक्सनिक मच्छर लार्वा पहले इंस्टार से परे विकसित करने में विफल रहता है जबकि एक बैक्टीरिया मौखिक आपूर्ति विकास को बचाता है, यह दर्शाता है कि लार्वा विकास13,,14के लिए मच्छर आंत माइक्रोब आवश्यक है। इसके अलावा, आंत बैक्टीरिया की कमी रक्त भोजन पाचन और पोषक तत्व अवशोषण को कम करती है, ओसाइट परिपक्वता को प्रभावित करती है, और ओविपोजिशन15को कम करती है। इसके अलावा, आंत माइक्रोफ्लोरा वाले मच्छर एंटीबायोटिक-उपचारित मच्छरों की तुलना में उच्च प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रकाश में लेते हैं, जिसमें अन्य रोगजनकों के खिलाफ लगातार ऊंचा एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड अभिव्यक्ति16को संक्रमित करने के लिए है। एंटीबायोटिक्स आमतौर पर मौखिक रूप से इन अध्ययनों में पैन आंत बैक्टीरिया को दूर करने के लिए प्रशासित कर रहे हैं, और फिर प्रयोगों के लिए कॉमेंसल रोगाणुओं के साथ एक्सनिक मच्छरों और मच्छरों के बीच अंतर की तुलना आयोजित कर रहे हैं । हालांकि, मच्छर मिडगुट रोगाणुओं के एक विविध समुदाय को बंदरगाहों, और प्रत्येक बैक्टीरिया प्रजातियों मेजबान शरीर विज्ञान की ओर एक अलग प्रभाव डालती सकता है ।
मच्छर माइक्रोबायोटा अलग प्रभाव के साथ वेक्टर क्षमता को नियंत्रित करता है। डेंगू-स्थानिक क्षेत्रों के क्षेत्र-व्युत्पन्न मच्छरों से अलग प्रोटियस द्वारा उपनिवेशीकरण16को अनियमित एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड अभिव्यक्ति और डेंगू वायरस संक्रमण के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करता है । एंटोमोपैथिक कवक ब्यूवेरिया बसियाना आर्बोवायरस संक्रमण17के खिलाफ टोल और जेएके-स्टेट प्रतिरक्षा मार्ग को सक्रिय करता है। इसके विपरीत, एडीज एजिप्टी मिडगट से अलग कवक तलरोमीसेस आंत ट्राइप्सिन गतिविधि18को मोडुलेट करके डेंगू वायरस संक्रमण की सुविधा प्रदान करता है। इसके अलावा, सेराटिया मार्सेसेन्स एसएमएनेवेंटिन नामक एक स्रावित प्रोटीन के माध्यम से आर्बोवायरस संचरण को बढ़ावा देताहै, जो मच्छरों के आंतों के एपिथेलियम पर म्यूसिन परत को पचाता है19।
यह प्रक्रिया मच्छर मिडगुट के विच्छेदन, कृषि योग्य बैक्टीरिया उपनिवेशों के अलगाव, बैक्टीरिया प्रजातियों की पहचान, और मौखिक भोजन के माध्यम से पुनर्परिचय के लिए एक व्यवस्थित और सहज विधि प्रदान करती है। यह मच्छर अंडाशय के विकास और अंडाशय पर एक अनुकूल जीवाणु, क्राइसोबैक्टीरियम मेनिंगोसेप्टिकम केसाथ रक्त आहार के प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन पर शोध में पाया गया है कि विभिन्न आंत रोगाणु अलग तंत्र के माध्यम से अपने मेजबान शरीर विज्ञान को प्रभावित करते हैं । यह लेख मच्छर आंत माइक्रोब की संबंधित भूमिका की जांच करने क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 81902094, 81600497) और हुन प्रांत की साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्लान प्रोजेक्ट (2019RS1036) ने सपोर्ट किया।
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission. Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1 (2019).
- Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes. Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69 (2018).
- Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses. Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).
- Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus. BMC Microbiology. 13 (1), 70 (2013).
- Chouaia, B., et al. Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species. Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).
- Terenius, O., et al. Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti. FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).
- Bando, H., et al. Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity. Scientific Reports. 3, 1641 (2013).
- Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).
- Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya. PloS One. 6 (9), (2011).
- Xiao, X., et al. A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut. Nature Microbiology. 2 (5), 17020 (2017).
- Guégan, M., et al. Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota. FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188 (2018).
- Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).
- Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. Mosquitoes rely on their gut microbiota for development. Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).
- de O Gaio, A., et al. Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L). Parasites & Vectors. 4 (1), 105 (2011).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).
- Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity. Elife. 6, 28844 (2017).
- Wu, P., et al. A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses. Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).
- Möhlmann, T. W., et al. Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes. Microbial Ecology. , (2020).
- Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).
- Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection. Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).
- Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti. Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).
- Eng, M. W., et al. Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186 (2018).
- Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents. Science Advances. 5 (1), 6141 (2019).
- Gonçalves, G. G. A., et al. Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes. Acta Tropica. 200, 105174 (2019).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector. BMC Microbiology. 9 (1), (2009).
- Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus. PLoS One. 7 (7), 40401 (2012).
- Behura, S. K. Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission. Nature. 436, 257-260 (2013).
- Dickson, L. B., et al. Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome. Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).
