Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit antibiotikabehandelten Moskitos
Summary
Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um die Wirkung einzelner Mückendarmbakterien zu untersuchen, einschließlich Isolierung und Identifizierung von Mücken-Mittelgut-anbaufähigen Mikroben, Antibiotika-Erschöpfung von Mückendarmbakterien und Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart.
Abstract
Die Mücke Midgut beherbergt ein hochdynamisches Mikrobiom, das den Wirtsstoffwechsel, die Fortpflanzung, die Fitness und die Vektorkompetenz beeinflusst. Es wurden Studien durchgeführt, um die Wirkung von Darmmikroben als Ganzes zu untersuchen; jedoch könnten verschiedene Mikroben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt ausüben. Dieser Artikel enthält die Methodik, um die Wirkung jeder spezifischen Mückendarmmikrobe und den potenziellen Mechanismus zu untersuchen.
Dieses Protokoll besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil stellt vor, wie man das Mückenmittelgut seziert, kultivierbare Bakterienkolonien isoliert und Bakterienarten identifiziert. Der zweite Teil sieht das Verfahren zur Erzeugung von antibiotikabehandelten Mücken und zur Wiedereinführung einer bestimmten Bakterienart vor.
Introduction
Mücken gelten als die wichtigsten Vektoren menschlicher pathogener Krankheiten, die über hundert Krankheitserreger übertragen, darunter das Zika-Virus, das Dengue-Virus und die Plasmodium-Parasiten 1. Wenn Mücken eine Blutmahlzeit nehmen, um Nährstoffe für die Oviposition zu erhalten, können sie versehentlich Krankheitserreger von einem infizierten Wirt über den Verdauungstrakt2aufnehmen. Wichtig ist, dass das Mückenmittelgut, das sowohl bei der Blutmahlzeit als auch beim Eintritt von Krankheitserregern eine zentrale Rolle spielt, ein hochdynamisches Mikrobiom3beherbergt.
Mehrere Studien haben labor- und feldgesammelte Mückenmikrobiota entweder mit einer kulturabhängigen Methode oder einem Bakteriensequenzierungstest4,5,6charakterisiert. Arten wie Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaund Enterococcus sind häufig von Mücken in verschiedenen Studienisoliert 5,7,8,9. Interessanterweise schwankt die Moskitodarmmikrobiota dynamisch sowohl in der Vielfalt der Gemeinschaft als auch in der Menge der Bakterienarten, die von der Entwicklungsphase, der Art, der geografischen Herkunft und dem Fütterungsverhalten betroffen sind4. Studien zeigen, dass die Blutfütterung die gesamte bakterielle Belastung mit einer schnellen Ausdehnung der Arten von Enterobacteriaceae und einer Verringerung der Gesamtvielfalt10,11dramatisch erhöht. Darüber hinaus wird Mückendarmmikrobiota des Larvenstadiums in der Regel ausgerottet, wenn das Insekt während der Pupation und Scheidung einer Metamorphose unterzogen wird; Daher müssen neu entstandene erwachsene Mücken ihre Mikrobiota4wieder bevölkern.
Gut mikrobiota moduliert Insektenphysiologie in verschiedenen Aspekten, einschließlich Nährstoffaufnahme, Immunität, Entwicklung, Reproduktion und Vektorkompetenz12. Axenic Mückenlarven nicht über den ersten Instar entwickeln, während ein Bakterium orale Versorgung rettet Entwicklung, was darauf hindeutet, dass die Mücke Darm Mikrobe ist wichtig für die Larvenentwicklung13,14. Außerdem, Erschöpfung der Darmbakterien verzögert Blutmehl Verdauung und Nährstoffaufnahme, wirkt sich auf die Oozytenreifung, und verringert oviposition15. Darüber hinaus lösen Mücken mit Darmmikroflora höhere Immunantworten im Vergleich zu antibiotikabehandelten Mücken aus, mit ständig erhöhter antimikrobieller Peptidexpression gegen andere Krankheitserreger, um16zu infizieren. Antibiotika werden in der Regel oral verabreicht, um Pan-Darm-Bakterien in diesen Studien zu entfernen, und dann werden Experimente durchgeführt, um den Unterschied zwischen axtischen Mücken und Mücken mit commenalen Mikroben zu vergleichen. Allerdings beherbergt die Mücke Midgut eine vielfältige Gemeinschaft von Mikroben, und jede Bakterienart könnte eine deutliche Wirkung auf die Wirtphysiologie ausüben.
Mückenmikrobiota reguliert Vektorkompetenz mit divergierenden Effekten. Die Kolonisation durch Proteus, isoliert von feldabgeleiteten Mücken von Dengue-endemischen Gebieten, verleiht eine hochregulierte antimikrobielle Peptidexpression und Resistenz gegen Dengue-Virusinfektionen16. Der entomopathogene Pilz Beauveria bassiana aktiviert den Toll- und JAK-STAT-Immunweg gegen eine Arbovirus-Infektion17. Im Gegensatz dazu erleichtert der aus Aedes aegypti midgut isolierte Pilz Talaromyces die Infektion des Dengue-Virus, indem er die Darmtrypsin-Aktivitätmoduliert 18. Darüber hinaus fördert Serratia marcescens die Arbovirus-Übertragung durch ein sekretorisches Protein namens SmEnhancin, das die Mucin-Schicht auf dem Darmepithel von Mückenverdaut 19.
Dieses Verfahren bietet eine systematische und intuitive Methode zur Zerlegung des Mückenmittelguts, zur Isolierung von kulturierbaren Bakterienkolonien, zur Identifizierung der Bakterienarten und zur Wiedereinführung durch orale Fütterung. Es liefert repräsentative Ergebnisse der Blutfütterung mit einem commensal Bakterium, Chryseobacterium Meningosepticum, auf Mücken EierstockEntwicklung und Oviposition.
Protocol
Representative Results
Discussion
Untersuchungen an Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen haben ergeben, dass verschiedene Darmmikroben ihre Wirtsphysiologie über divergierende Mechanismen beeinflussen. Dieser Artikel stellt die Methode vor, um die jeweilige Rolle der Moskito-Darm-Mikrobe zu untersuchen, einschließlich der Sezieren von Mückenmittelgut, Kultivieren von kultivierbaren Darmbakterien, Antibiotika-Behandlung, und Wiedereinführung der Bakterien von Interesse.
Für eine erfolgreiche Antibiotikabehandlung müssen bei der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) und dem Science and Technology Plan Project der Provinz Hunan (2019RS1036) unterstützt.
Materials
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate has been used to prepare adenosine triphosphate (ATP) standard solutions |
| Aedes aegypti | Female mosquitoes | ||
| Anticoagulant tube | BD Vacutainer | 363095 | Collect fresh blood |
| Centrifuge tube | Sangon Biotech | F601620-0010 | 1.5 ml, Natural, Graduated, Sterile |
| Cotton balls | |||
| Disposable Tissue Grinding Pestle | Sangon Biotech | F619072-0001 | 70 mm Long, Conical, Blue, Sterile |
| Ethanol absolute | Paini | Dilute it to 75% ethanol | |
| Forceps | RWD | F11029 | Dissection |
| Hemotek Membrane Feeding System | Hemotek | Components of the feeding system, including Hemotek temperature controller, feeder-housing assembly, metal feeder assembled. | |
| Incubator shaker | ZQZY-78AN | ||
| Inoculation Loops | Sangon Biotech | F619312-0001 | 10 μl, Yellow |
| LB Agar Powder | Sangon Biotech | A507003 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g； Agar 15.0 g. |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002 | Tryptone 10.0 g； Yeast Extract 5.0 g； NaCl 10.0 g. |
| Microscope | Zeiss | Stemi508 | |
| Paper cup | Place mosquito | ||
| Parafilm | Sangon Biotech | F104002 | 4 inx 125 ft |
| Petri dish | Sangon Biotech | F611203 | |
| Penicillin G procaine salt hydrate | Sangon Biotech | A606248 | White powder. Soluble in water, soluble in methanol, slightly soluble in water, ethanol |
| Single Channal Pipettor | Gilson | ||
| Streptomycin sulfate | Sangon Biotech | A610494 | Streptomycin sulfate is a glucosamine antibiotic that interferes with the synthesis of prokaryotic proteins. |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | Soluble in water, ethanol and methanol, slightly soluble in glycerol and pyridine. |
| TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN | DP302 | Extract DNA |
| Utility Fabric-Mosquito Netting White | |||
| Vortex mixer | Scintic Industries | S1-0246 | |
| 1.5ml EP tube | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10X PBS buffer | Sangon Biotech | E607016 | This product is a 10X solution. Please dilute it 10 times before use. The pH value is 7.4. |
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