Descritto qui è un metodo efficace su come produrre elevati stock di titro virale del virus dell’epatite E (HEV) per infettare in modo efficiente le cellule dell’epatoma. Con il metodo presentato, sia le particelle virali non avvolte, sia le particelle virali avvolte possono essere raccolte e utilizzate per inoculare varie linee cellulari.
Il virus dell’epatite E è la principale causa di cirrosi epatica e insufficienza epatica con crescente prevalenza in tutto il mondo. Il virus dell’RNA a singolo filamento è trasmesso prevalentemente da trasfusioni di sangue, condizioni sanitarie inadeguate e prodotti alimentari contaminati. Ad oggi il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti. Tuttavia, resta da identificare un trattamento specifico heV. Finora, le conoscenze sul ciclo di vita e sulla patogenesi HEV sono state gravemente ostacolate a causa della mancanza di un efficiente sistema di coltura cellulare HEV. Un robusto sistema di coltura cellulare è essenziale per lo studio del ciclo di vita virale che include anche la patogenesi virale. Con il metodo qui descritto si possono produrre titer virali fino a 3 x 106 messa a fuoco formando unità/mL (FFU/mL) di HEV non invilita e fino a 5 x 104 FFU/mL di HEV inviluppo. Utilizzando queste particelle, è possibile infettare una varietà di cellule di origini diverse, tra cui cellule primarie e umane, così come linee cellulari animali. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo estremamente efficiente.
L’epatite E è una malattia abbastanza sottovalutata con una crescente prevalenza in tutto il mondo. Circa 20 milioni di infezioni provocano più di 70.000 decessi all’anno1. L’agente sottostante, il virus dell’epatite E (HEV), è stato riassegnato di recente ed è ora classificato all’interno della famiglia Hepeviridae tra cui i generi Orthohepevirus e Piscihepevirus. HEV di varie origini sono classificati all’interno della specie Orthohepevirus A-D compresi isolati da esseri umani, suini, conigli, ratti, uccelli e altri mammiferi2. Attualmente, sono stati identificati otto diversi genotipi (GT) del virus dell’RNA a singolo filamento positivo e a filamentosingolo 2. Sebbene differiscano nella loro identità di sequenza, nelle vie di trasmissione e nella distribuzione geografica, la loro struttura genomica è altamente conservata. Più specifico, il genoma HEV da 7,2 kbp è diviso in 3 grandi frame di lettura aperti (ORF1-3). Mentre ORF1 codifica tutti gli enzimi necessari per una replicazione di successo all’interno della cellula ospite, ORF2 codifica la proteina capside, e la proteina ORF3 opera come un canale ionico funzionale necessario per l’assemblaggio e il rilascio di particelle infettive3. Una volta rilasciato nel lume basale o apicale HEV esiste in entrambe, quasiavvolto e non-avvolto/nudo specie a seconda se il virus proviene da sangue o feci, rispettivamente4,5.
Mentre GT1 e GT2 si trovano principalmente nei paesi in via di sviluppo che infettano esclusivamente gli,esseri umani6 attraverso la via fecale-orale, GT3, GT4 e GT7 si verificano prevalentemente nei paesi sviluppati1,7 con una varietà di specie che servono come serbatoi, ad esempio, suini8, ratto9, pollo10,11, cervo12, mangusta13, pipistrello14, coniglio15,16, cinghiale17 e molti altri7,18,19, fornendo prove di zoonosi7,20,21. Oltre a condizioni sanitarie inadeguate23 e prodotti alimentari contaminati12,24,25,26, trasmissione tramite trasfusione di sangue e trapianti di organi è possibile anche27,28. HEV è una causa comune di cirrosi epatica e insufficienza epatica29 soprattutto nei pazienti con malattia epatica preesistente, individui immunocompromessi (genotipo 3, 4 e 7) e donne incinte (genotipo 1). Da notare, ci sono anche manifestazioni extraepatiche come la malattia ematopoietica30,31,32, disturbi neurologici33 e lesioni renali34.
Ad oggi, il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti infetti35,36. Tuttavia, sono stati segnalati casi di fallimento del trattamento e scarsi esiti clinici a lungo termine. Il fallimento del trattamento è stato collegato alla mutagenesi virale e all’aumento dell’eterogeneità virale nei pazienti cronicamente infetti37,38,39. Al contrario, un recente studio multicentrico retrospettivo europeo non è stato in grado di correlare le mutazioni della polimerasi al fallimento del trattamento RBV40. Nelle osservazioni cliniche e negli esperimenti in vitro, l’interferone41,42,43, il sofosbuvir44,45, i sali di zinco46 e la silvestrol47,48 hanno anche mostrato effetti antivirali. Ciò nonostante, rimane un trattamento specifico HEV, ostacolato dalla mancanza di conoscenza circa il ciclo di vita HEV e la sua patogenesi. Pertanto, è urgentemente necessario un solido sistema di coltura cellulare per gli studi virologici e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali49.
Sfortunatamente, come altri virus dell’epatite, HEV è difficile da propagare nelle linee cellulari convenzionali e di solito progredisce molto lentamente portando a bassi carichi virali. Tuttavia, alcuni gruppi sono stati in grado di aumentare i carichi virali con la generazione di subcloni linea cellulare50 o la regolazione dei supplementi multimediali51. Recentemente la generazione di cloni cDNA52 e l’adattamento del paziente primario isola passando53,54 ulteriormente migliorato la propagazione HEV nella coltura cellulare55. In questo protocollo, abbiamo usato il genoma di una coltura cellulare adattata ceppo Dikernow-C1 (noto come p6_WT)54 e un ceppo mutante che ospita una mutazione che migliora la replicazione (indicata come p6_G1634R)37. Kernow-C1 è il ceppo più usato nella coltura cellulare HEV ed è in grado di produrre carichi virali elevati. Valutando i numeri di copia dell’RNA virale, la replicazione HEV può essere monitorata in vitro. Tuttavia, queste tecniche non consentono la valutazione del numero di particelle infettive prodotte. Pertanto, abbiamo stabilito una colorazione immunofluorescenza per determinare le unità di formatura a fuoco (FFU/mL).
Il metodo qui descritto56 può essere utilizzato per produrre particelle virali infettive a tutta lunghezza che sono in grado di infettare una varietà di tipi di cellule provenienti da diverse origini, tra cui cellule primarie e linee cellulari di mammiferi. Questo è un prerequisito fondamentale per decifrare aspetti importanti dell’infezione e del tropismo HEV. Non è necessario l’inoculazione con isolati di pazienti solitamente limitati. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo relativamente efficiente. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per la genetica inversa che consente lo studio dell’alterazione del genoma identificato in vivo e il loro impatto sulla replicazione e la forma fisica dell’HEV. Questa tecnica supera molti limiti e, può tracciare la strada per lo sviluppo di farmaci, gli studi di mutagenesi e la valutazione delle interazioni virus-ospite come fattori di restrizione o di ingresso.
A partire dalla preparazione del plasmide, i rendimenti del DNA dovrebbero superare i 150 ng/L per poter eseguire la linearizzazione multipla dallo stesso stock di plasmide, il che riduce al minimo il rischio di mutagenesi indotta da batteri di sequenze di genoma cruciali. Inoltre, è importante controllare il digest di restrizione per la linearizzazione plasmidcompleta completa da elettroforesi gel (Figura 8b). Una mancanza di DNA plasmide linearizzato indurrebbe l’amplificazione del cerchi…
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati a Suzanne Emerson per il clone del virus dell’epatite E p6. Il siero iperimmune per conigli operistici per il coniglio È stato gentilmente fornito da Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germania. Inoltre, ringraziamo tutti i membri del Dipartimento di Virologia Molecolare e Medicina della Ruhr University Bochum per il loro sostegno e discussione. Le cifre 1-7 sono state generate con BioRender.com.
0.45 µm mesh | Sarstedt | 83.1826 | Harvest extracellular Virus |
4 % Histofix | CarlRoth | P087.4 | Immunofluorescence |
Acetic acid | CarlRoth | 6755.1 | Collagen working solution |
Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Virus harvesting |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | Selection of transformed bacteria |
ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcription and electroporation |
BioRender | BioRender | Figure Generation | |
CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
Collagen R solution 0.4 % sterile | Serva | 47256.01 | Collagen working solution |
CTP | Roche | 11140922001 | in vitro transcription |
Cuvette | Biorad | 165-2088 | Electroporation |
DAPI | Invitrogen | D21490 | Immunofluorescence |
DMEM | gibco | 41965-039 | Cell culture |
DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcription |
DTT | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformation |
Fetal bovine serum | gibco | 10270106 | Cell culture |
Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Immunofluorescence |
GenePulser Xcell Electroporation System | BioRad | 1652660 | Electroporation |
Gentamycin | gibco | 15710049 | Cell culture |
GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcription |
H2O | Braun | 184238001 | Immunofluorescence |
Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
Horse serum | gibco | 16050122 | Immunofluorescence |
K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
L-Glutamin | gibco | 25030081 | Cell culture |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
MEM | gibco | 31095-029 | Cell culture |
MEM NEAA (100×) | gibco | 11140-035 | Cell culture |
MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | DNA/RNA concentration |
MluI enzyme | NEB | R0198L | Linearization |
NEB buffer | NEB | included in R0198L | Linearization |
NucleoSpin Plasmid kit | Macherey & Nagel | 740588.250 | Plasmid preparation |
NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | RNA purification |
PBS | gibco | 70011051 | Cell culture |
Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cell culture |
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R) | Todt et.al | Virus production | |
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT) | Shukla et al. | GenBank accession no. JQ679013 | Virus production |
Primary antibody 1E6 | LS-Bio | C67675 | Immunofluorescence |
Primary antibody 8282 | Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | DNA extraction |
Ribo m7G Cap Analog | Promega | P1711 | in vitro transcription |
RNase away | CarlRoth | A998.3 | RNA purification |
RNasin (RNase inhibitor) | Promega | N2515 | in vitro transcription |
Secondary antibody donkey anti-mouse 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Immunofluorescence |
Secondary antibody goat anti-rabbit 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Immunofluorescence |
Sodium Pyruvat | gibco | 11360070 | Cell culture |
T7 RNA polymerase | Promega | P2077 | in vitro transcription |
Transcription Buffer | Promega | included in P2077 | in vitro transcription |
Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Immunofluorescence |
Trypsin-EDTA (0.5 %) | gibco | 15400054 | Cell culture |
ultra-low IgG | gibco | 1921005PJ | Cell culture |
UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcription |