Um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite E de alta titer

Summary

Descrito aqui é um método eficaz sobre como produzir altos estoques virais de vírus de hepatite E (HEV) para infectar eficientemente as células hepatomas. Com o método apresentado, tanto não envolta, quanto partículas virais envoltas podem ser colhidas e utilizadas para inocular várias linhas celulares.

Abstract

O vírus da hepatite E é a principal causa de cirrose hepática e insuficiência hepática com prevalência crescente em todo o mundo. O vírus RNA de uma única cadeia é predominantemente transmitido por transfusões de sangue, condições sanitárias inadequadas e produtos alimentares contaminados. Até o momento, a droga fora do rótulo ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes. No entanto, um tratamento específico de HEV ainda precisa ser identificado. Até agora, o conhecimento sobre o ciclo de vida hev e a patogênese tem sido severamente dificultado devido à falta de um sistema eficiente de cultura celular HEV. Um sistema de cultura celular robusto é essencial para o estudo do ciclo de vida viral que também inclui a patogênese viral. Com o método descrito aqui pode-se produzir titers virais de até 3 x 10⁶ unidade de formação de foco/mL (FFU/mL) de HEV não envolto e até 5 x 10⁴ FFU/mL de HEV envolto. Usando essas partículas, é possível infectar uma variedade de células de diversas origens, incluindo células primárias e humanas, bem como linhas de células animais. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo extremamente eficiente.

Introduction

A hepatite E é uma doença bastante subestimada com aumento da prevalência em todo o mundo. Cerca de 20 milhões de infecções resultam em mais de 70.000 mortes por ano¹. O agente subjacente, o vírus da Hepatite E (HEV), foi transferido recentemente e agora é classificado dentro da família Hepeviridae, incluindo os gêneros Ortohepevirus e Piscihepevirus. HEV de várias origens são classificados dentro da espécie Orthohepevirus A-D, incluindo isolados de humanos, suínos, coelhos, ratos, aves e outros mamíferos². Atualmente, foram identificados oito genótipos diferentes (GT) do vírus RNA de rna de apenas encalhe positivamente². Embora diferam em sua identidade sequencial, rotas de transmissão e distribuição geográfica, sua estrutura genômica é altamente conservada. Mais específico, o genoma HEV de 7,2 kbp é dividido em 3 principais quadros de leitura aberta (ORF1-3). Enquanto o ORF1 codifica todas as enzimas necessárias para uma replicação bem sucedida dentro da célula hospedeira, o ORF2 codifica a proteína capsid, e a proteína ORF3 opera como um canal de íon funcional necessário para montagem e liberação de partículas infecciosas³. Uma vez liberado no lúmen basal ou apical HEV existe em ambas as espécies quasienveloped e não-envolto/nu, dependendo se o vírus se origina de sangue ou fezes,^{respectivamente 4,5}.

Enquanto GT1 e GT2 são encontrados principalmente em países em desenvolvimento infectando^apenas humanos 6 através da rota fecal-oral, GT3, GT4 e GT7 ocorrem predominantemente nos países desenvolvidos^1,7 com uma variedade de espécies servindo como reservatórios, por exemplo, suíno⁸, rato⁹, frango^10,11, veado¹², mangusto¹³, morcego¹⁴, coelho^15,16, javali selvagem¹⁷ e muito mais^7,18,19, fornecendo evidências de zoonose^7,20,21,22. Além das condições sanitárias inadequadas²³ e dos produtos alimentícios contaminados^{12,24,,25,,26}, a transmissão via transfusão de sangue e transplantes de órgãos também é possível^27,28. O HEV é uma causa comum de cirrose hepática e insuficiência hepática^{29 especialmente} em pacientes com doença hepática pré-existente, indivíduos imunocomprometidos (genótipo 3, 4 e 7) e gestantes (genótipo 1). Note-se que há também manifestações extrahápticas como a doença hematopoiética^30,31,,32, distúrbios neurológicos³³ e lesão renal³⁴.

Até o momento, o medicamento off-label ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes infectados^35,36. No entanto, casos de falha no tratamento e desfechos clínicos ruins a longo prazo foram relatados. A falha no tratamento tem sido associada à mutagênese viral e ao aumento da heterogeneidade viral em pacientes cronicamente infectados^37,38,39. Pelo contrário, um estudo multicêntrico retrospectivo europeu recente não foi capaz de correlacionar mutações de polimerase à falha do tratamento RBV⁴⁰. Em observações clínicas e experimentos in vitro, interferon^41,42,43, sofosbuvir^44,45, sais de zinco⁴⁶ e silvestrol^47,48 também mostraram efeitos antivirais. No entanto, ainda há um tratamento específico de HEV, dificultado pela falta de conhecimento sobre o ciclo de vida hev e sua patogênese. Portanto, é^urgenteum sistema de cultura celular robusto para estudos virológicos e o desenvolvimento de novas drogas antivirais.

Infelizmente, como outros vírus da hepatite, o HEV é difícil de propagar em linhas celulares convencionais e geralmente progride muito lentamente levando a baixas cargas virais. No entanto, alguns grupos foram capazes de aumentar as cargas virais pela geração de subclones de linha^{celular 50} ou pelo ajuste dos suplementos de mídia⁵¹. Recentemente, a geração de clones cDNA⁵² e a adaptação dos isolados do paciente primário pela passagem^53,54 melhorou ainda mais a propagação de HEV na cultura celular⁵⁵. Neste protocolo, usamos o genoma de uma cultura celular adaptada linhame a cepa Kernow-C1 (chamada de p6_WT)⁵⁴ e uma cepa mutante que abriga uma mutação que aumenta a replicação (chamada de p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 é a cepa mais usada na cultura celular HEV e é capaz de produzir altas cargas virais. Ao avaliar os números de cópias do RNA viral, a replicação hev pode ser monitorada in vitro. No entanto, essas técnicas não permitem avaliar o número de partículas infecciosas que estão sendo produzidas. Por isso, estabelecemos uma coloração de imunofluorescência para determinar unidades de formação de foco (FFU/mL).

O método⁵⁶ aqui descrito pode ser usado para produzir partículas virais infecciosas de comprimento total que são capazes de infectar uma variedade de tipos celulares de diversas origens, incluindo células primárias e linhas celulares de mamíferos. Este é um pré-requisito fundamental para decifrar aspectos importantes da infecção por HEV e do tropismo. Não há necessidade de inoculação com isolados geralmente limitados de pacientes. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo comparativamente eficiente. Além disso, esse sistema pode ser usado para genética reversa, permitindo o estudo da alteração do genoma identificada in vivo e seu impacto na replicação e aptidão do HEV. Essa técnica supera muitas limitações e pode trilhar o caminho para o desenvolvimento de medicamentos, estudos de mutagênese e a avaliação de interações vírus-hospedeiros, como fatores de restrição ou entrada.

Protocol

NOTA: Todos os experimentos são realizados sob a condição BSL-2. Todos os materiais que entram em contato com o vírus da hepatite E RNA ou vírus infeccioso devem ser enxaguados adequadamente com 4% de Kohrsolin FF de um recipiente de resíduos dentro do capô antes do descarte. 1. Preparação plasmid Inoculado 200 mL LB médio contendo 100 μg/mL ampicillin com Escherichia coli JM109 transformado incorporando uma codificação plasmida para a sequência HEV gt3 Kernow-…

Representative Results

Neste protocolo, descrevemos a produção de alto título infeccioso HEVcc. O primeiro passo é isolar o DNA plasmídeo (pBluescript_SK_HEVp654 e pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que então é linearizado pela digestão de restrição e purificado para transcrição in vitro(Figura 1). Uma linearização bem sucedida pode ser verificada comparando o plasmídeo-DNA não digerido com o plasmídeo digerido-D…

Discussion

A partir da preparação plasmida, os rendimentos de DNA devem exceder 150 ng/μL para poder realizar uma linearização múltipla a partir do mesmo estoque plasmídeo, o que minimiza o risco de mutagênese induzida por bactérias de sequências de genomas cruciais. Além disso, é importante verificar a digestão de restrição para a linearização plasmida completa por eletroforese gel (Figura 8b). A falta de DNA plasmídeo linearizado induziria a amplificação do círculo de rolamento f…

Materials

0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Harvest extracellular Virus
4 % Histofix	CarlRoth	P087.4	Immunofluorescence
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	Collagen working solution
Amicon Ultra-15	Merck Millipore	UFC910024	Virus harvesting
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A1593	Selection of transformed bacteria
ATP	Roche	11140965001	in vitro transcription and electroporation
BioRender	BioRender		Figure Generation
CaCl2	Roth	5239.2	Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Collagen working solution
CTP	Roche	11140922001	in vitro transcription
Cuvette	Biorad	165-2088	Electroporation
DAPI	Invitrogen	D21490	Immunofluorescence
DMEM	gibco	41965-039	Cell culture
DNAse	Promega	M6101	in vitro transcription
DTT	Promega	included in P2077	in vitro transcription
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
Escherichia coli JM109	Promega	L2005	Transformation
Fetal bovine serum	gibco	10270106	Cell culture
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01	Immunofluorescence
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Electroporation
Gentamycin	gibco	15710049	Cell culture
GTP	Roche	11140957001	in vitro transcription
H2O	Braun	184238001	Immunofluorescence
Hepes	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Horse serum	gibco	16050122	Immunofluorescence
K2HPO4	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
KH2PO4	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Cell culture
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cell culture
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cell culture
MgCl2	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA concentration
MluI enzyme	NEB	R0198L	Linearization
NEB buffer	NEB	included in R0198L	Linearization
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey & Nagel	740588.250	Plasmid preparation
NucleoSpin RNA Clean-up Kit	Macherey & Nagel	740948.250	RNA purification
PBS	gibco	70011051	Cell culture
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cell culture
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_G1634R)	Todt et.al		Virus production
Plasmid encoding full-length HEV genome (p6_WT)	Shukla et al.	GenBank accession no. JQ679013	Virus production
Primary antibody 1E6	LS-Bio	C67675	Immunofluorescence
Primary antibody 8282			Rainer Ulrich, Friedrich Loeffler Institute, Germany
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	DNA extraction
Ribo m7G Cap Analog	Promega	P1711	in vitro transcription
RNase away	CarlRoth	A998.3	RNA purification
RNasin (RNase inhibitor)	Promega	N2515	in vitro transcription
Secondary antibody donkey anti-mouse 488	Thermo Fisher	A-21202	Immunofluorescence
Secondary antibody goat anti-rabbit 488	Thermo Fisher	A-11008	Immunofluorescence
Sodium Pyruvat	gibco	11360070	Cell culture
T7 RNA polymerase	Promega	P2077	in vitro transcription
Transcription Buffer	Promega	included in P2077	in vitro transcription
Triton X-100	CarlRoth	3051.3	Immunofluorescence
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Cell culture
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Cell culture
UTP	Roche	11140949001	in vitro transcription