用于植物微RNA检测和定量的RNA斑点分析
Summary
此方法演示了利用北方杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。
Abstract
MicroRNA （miRNA） 是一类内源性表达的非编码，±21 nt 小型RNA参与植物和动物基因表达的调控。大多数miRNA充当针对关键基因的基因表达的负开关。在植物中，原发性miRNA（原始miRNA）转录本由RNA聚合酶II生成，它们形成不同长度的稳定茎环结构，称为前miRNA。内核糖酶，像迪瑟一样1，将预米RNA处理成miRNA-miRNA*双工。从miRNA-miRNA* 双面的一股被选择并加载到Argonaute 1蛋白或其同源体上，以调解目标mRNA的裂解。虽然miRNA是关键信号分子，但它们的检测通常采用不太理想的基于PCR的方法，而不是敏感的北方印迹分析。我们描述了一种简单、可靠和极其敏感的北方方法，它非常适合从任何植物组织中对具有极高灵敏度的 miRNA 水平进行定量。此外，此方法可用于确认米RNA及其前体的尺寸、稳定性和丰度。
Introduction
最近发现的小型调控RNA，微RNA，已经领导了研究，了解它们及其在植物和动物中的作用1。miRNA的长前体由HYL1和特定的骰子样蛋白质2，3加工成21至24nt成熟的3miRNA。22 nt miRNA 可以通过生成二级 siRNA4启动级联沉默。研究表明，miRNA和二级siRNA在发育、细胞命运和压力反应5，6,中的作用。
北方杂交是一种常规用于检测特定RNA分子的实验方法。此方法自定义其在检测大约 19 -24 nt 长的小 RNA 从总 RNA7 的池中的使用。在此演示中，我们演示了该技术用于检测和定量 miRNA。该方法使用放射性同位素对探头进行标签标记;因此，可以提高灵敏度检测样品中的miRNA水平。与基于 PCR 的方法不同，此方法可确保表达式的量化以及 miRNA 的大小确定。在该协议中，我们展示改善miRNA检测的关键步骤。我们修改了印迹和杂交步骤，以获得 miRNA 的高分辨率信号检测。此技术还可用于检测其他内生小RNA，如 siRNA、tasi-辅助RNA 和 snoRNA。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方法可广泛用于检测和定量小RNA，包括不太丰富的miRNA。该协议主要描述了在加载缓冲液中变性总RNA的步骤，通过凝胶电泳进行大小分离，将RNA转移到膜上，将RNA交叉链接到膜，并使用所需的放射性标记寡聚探针进行杂交。
任何印迹实验的关键步骤是使用优质RNA进行样品制备。在装载凝胶之前，必须确保样品自由流动，不要粘在装料尖端。装载样品时必须小心，尖端应插入…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者承认宿主研究所和英国为放射性同位素提供的辐射实验室。PVS实验室由国家生物科学中心、塔塔基础研究所和赠款支持（BT/PR12394/AGIII/103/891/2014;BT/IN/瑞士/47/JGK/2018-19;BT/PR25767/GET/119/151/2017） 来自印度政府生物技术部。MP 承认印度政府 DBT 研究助理。
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
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